МУ Микробиология Лабораторные

ворсинки проникают в лимфу и кровь, разносятся по организму и снова размно-

жаются. Высвобождаются эндотоксины, действующие на организм.

Клинические признаки. Сальмонеллез может протекать в виде первичного заболевания с характерными клиническими признаками и в виде секундарной ин-

фекции (признаки сглаживаются). Носители представляют опасность как источ-

ник инфекции и пищевых отравлений.

Инкубационный период - до 7 суток. При остром течении – угнетение, лихо-

радка, телята становятся малоподвижными, вялыми и сонливыми, лежат. На 2 - 3

день появляются признаки расстройства пищеварения. Фекалии жидкие, серо-

желтой окраски с примесью слизи, пузырьков газа, крови, и издают противный сладковатый запах. В дальнейшем понос усиливается, и жидкие массы вытекают из ануса непроизвольно. У некоторых телят наблюдается дрожание и подергива-

ние бедренной и локтевой групп мышц.

Лабораторная диагностика. Патологический материал: кровь в первые дни заболевания, истечения из родовых путей, фекалии. У птиц исследуют кровь со специфическим антигеном в пластинчатой РА. Посмертно в лабораторию направ-

ляют свежий трупы мелких животных и птиц, от трупов крупных животных - па-

ренхиматозные органы или их части, мезентеральные лимфатические узлы, труб-

чатую кость, от телят - измененные участки легких; в случае аборта - свежий плод.

Микроскопия мазков, посев на МПБ, МПА и дифференциальные среды - Эн-

до, Плоскирева или висмут-сульфит агар, а при подозрении на хроническое тече-

ние болезни дополнительно на одну из сред накопления (селенитовую, Мюллера и др.). Проводят идентификацию на основании морфологических, культуральных,

биохимических и антигенных свойств согласно существующим наставлениям.

Проводят биопробу – заражение мышей.

РАс сальмонеллезными сыворотками для выделения антигенов. При О-

агглютинации при сравнительно медленном течении реакции (учет ее спустя 20-24

часа при комнатной температуре) в пробирке образуются мелкозернистые хлопья.

191

При Н-агглютинации – более грубые агрегаты и быстрое наступление агглютинации (спустя 1-2 часа при 37 °С).

МФА. Феномен бактериофагии.

Иммунитет формируется к определенному серотипу. Носит антиинфекционный и антитоксический характер. Вначале формируется нестерильный имму-

нитет, который в дальнейшем может стать стерильным. В создании иммунитета значение имеет первая доза антигена. Чрезмерная доза вызывает угнетение иммунных сил организма, а малые дозы нейтрализуются организмом и, следова-

тельно, не вызывают иммунитета. Оптимальной иммунизирующей дозой некоторые авторы считают 2 млн. микробных тел. Для формирования стойкого иммунитета необходима определенная степень и продолжительность антигенного воздействия (персистенция живых бактерий в тканях).

Специфическая терапия. Сыворотки антитоксические. Колигертнер-фаг. Антибиотики после подтитровки. АБК, ПАБК. Сульфаниламидные препараты.

Основным принципом лечения больных сальмонеллезом животных является детоксикация организма.

Специфическая профилактика.

1.Вакцина концентрированная фармолквасцовая против сальмонеллеза телят.

2.Вакцина концентрированная фармолквасцовая против сальмонеллеза поро-

сят.

3.Вакцина фармолтиомерсаловая поливалентная против сальмонеллезов.

4.Вакцина поливалентная против сальмонеллеза и колибактериоза пушных зверей.

5.Вакцина ассоциированная против сальмонеллеза, пастереллеза и энтерококковой инфекции поросят.

6.Живая вакцина из штамма Sal. dublin №6.

7.Вакцина против сальмонеллеза свиней из штамма ТС-177.

Контрольные вопросы:

1. Какой патологический материал берут при жизни для лабораторной диа-

гностики эшерихиоза и сальмонеллёза

192

2.Можно ли по морфологии и тинкториальным свойствам отличить эшери-

хии от сальмонелл

3.Что общего и в чем различия патогенных эшерихий и представителей нормальной микрофлоры

4.Охарактеризуйте основные типы взаимодействия патогенных эшерихий с кишечным эпителием

5.Какие дифференциально-диагностические среды применяют для иденти-

фикации эшерихий от сальмонелл

6.Существует ли возрастная восприимчивость молодняка к патогенным эше-

рихиям и чем это можно объяснить.

7.Как идентифицировать эшерихии и сальмонеллы по антигенной структуре

8.Перечислить пути проникновения сальмонелл в сырое и готовое мясо

9.Могут ли размножаться сальмонеллы при температуре минус 4 °С.

10.Какими исследованиями можно определить сальмонеллёзоносительство,

если из-за достаточного уровня иммунной защиты заболевание не проявляется.

Тема 3.10. Микробиологическая диагностика бруцеллеза и туляремии.

Цель занятия: ознакомить студентов с видами возбудителей бруцеллеза и с возбудителем туляремии; определить на чем основана идентификация и диффе-

ренциация бруцелл, знать источники заражения, механизм заражения, высокую инвазивность возбудителя.

Содержание:

1.Патологический материал.

2.Микроскопия мазков.

3.Культуральные и биохимические свойства возбудителя.

4.Биологическая проба.

5.Специфическая терапия и профилактика болезни.

6.Некоторые особенности заболевания.

193

ВОЗБУДИТЕЛИ БРУЦЕЛЛЕЗА (Brucellosis)

Род Brucella

Brucella melitensis – у мелкого рогатого скота и человека

B.abortus – крупного рогатого скота

B. suis – у свиней, зайцев, северных оленей

B.ovis – у овец, вызывает инфекционный эпидидимит баранов

B.neotomae – у грызунов

B. canis – у собак

Хроническая инфекционная болезнь всех млекопитающих, в том числе и че-

ловека. У собак болезнь протекает в виде периодических лихорадок, а также пато-

логий со стороны репродуктивных органов. Эта болезнь у собак крайне плохо изучена и представляет очень большую опасность для владельцев животного. Бо-

лезнь характеризуется поражением полового аппарата и опорно-двигательной си-

стемы, а у человека, наоборот, сначала поражается опорно-двигательная система, а

затем половая система. В начальном периоде энзоотии проявляется массовыми абортам и осложнениями, возникающими после аборта. Бруцеллы – факультатив-

ные внутриклеточные паразиты. Живут и размножаются преимущественно внутри

клеток РЭС.

Бруцеллез был известен еще древним египтянам и грекам, а небольшой ост-

ров Мальта в Средиземном море дал свое имя этой опасной болезни животных и людей. В 1886 г. на острове Мальте английский военный врач Д. Брюс обнаружил возбудителя болезни в селезенке трупа человека, погибшего от бруцеллеза («маль-

тийской лихорадки»), а через год получил чистую культуру бруцелл.

этому используют окраску по Козловскому: препарат окрашивают 2 % водным

194

раствором сафранина с подогреванием до появления пузырьков, после промывки водой дополнительно окрашивают 1 % водным раствором малахитовой зелени 30

секунд - бруцеллы окрашиваются в ярко-красный цвет, а прочие бактерии - в зеле-

ный, по Ганзену или Стампу. В мазках из патологического материала и культур бруцеллы располагаются одиночно, парами или кучками.

Культуральные свойства. Факультативные анаэробы. B. abortus и B. ovis –

микроаэрофилы (требуют для выращивания повышенного содержания углекисло-

ты). Растут при низком содержании кислорода (5-10 %). Растут медленно. Выде-

ление культур бруцелл из патологического материала на питательных средах в первых генерациях удается в среднем спустя 1 мес., а иногда и позже. Лаборатор-

ные культуры бруцелл развиваются уже через 1-2 дня. Для выращивания исполь-

зуют среды, обогащенные глюкозой, декстрозой, глицерином, печеночным бульо-

ном, сывороткой. Для выделения культуры бруцелл из загрязненных посторонней микрофлорой биоматериалов пользуются этими же средами после добавления к ним антибиотиков, не препятствующих росту бруцелл (полимиксин, бацитрацин,

антидион, циклогексамид). На жидких питательных средах – слабое помутнение,

осадок пылевидный, в виде тонкой косички, иногда нежное пристеночное кольцо.

На плотных питательных средах – мелкие круглые прозрачные росинчатые коло-

нии. Со временем они приобретают серо-желтую, вплоть до коричневой окраски.

Вирулентные штаммы (S-формы) круглые, выпуклые, гладкие и с ровными края-

ми; авирулентные (R-форма) – шероховатые. Для дифференциации S- и R-форм колоний бруцелл Уайт и Вильсон предложили специальный метод их окраски.

Используемую культуру засевают на агар-Альбими (дрожжевой автолизат), в тер-

мостат при 37 °С на 4 дня, затем на поверхность агара с выросшей культурой наливают водный раствор кристалллвиолета на 15 секунд. Краску сливают в дез-

инфицирующий раствор, а колонии рассматривают под лупой или микроскопом.

S-колонии светлые, а R-колонии – фиолетовые.

Биохимические свойства. Малоактивны. Не содержат протеолитических ферментов, поэтому не разжижают желатин и не пептонизируют молоко. Кровя-

ные среды не гемолизируют. Углеводы разлагают, но кислота и газ образуются в

195

малом количестве, недостаточном для их дифференциации, и не все штаммы. Ин-

дол не образуют. Нитраты редуцируют в нитриты. Некоторые виды образуют се-

роводород: B. suis +, B. melitensis-, B. abortus слабо +.

Устойчивость. В брынзе, почве - до 2 мес., в навозе - до 4 мес., в шерсти и коже - до 4 мес. 60 °С - 30 мин, 80 °С - 5 мин, кипячение - моментально. Прямые солнечные лучи – до 3-4 часов. Хлорная известь (25 % активного хлора), лизол,

креолин, хлорамин, 2 – 3 % карболовая кислота - 5 мин. Пастеризацию молока проводят при 85-90 °С – 290 секунд или при 70 °С – 30 мин.

Антигенная структура. Соматический комплекс – антиген Буавена (эндо-

токсин), весьма токсичный для животных.

Патогенез. Бруцеллы проникают в организм через кожу или слизистые обо-

лочки, захватываются макрофагами, размножаются в них и током лимфы заносят-

ся в регионарные лимфоузлы, а затем в кровь. Развивается кратковременная бак-

териемия. Бруцеллы могут длительно сохраняться в лимфоузлах, обусловливая иммунологическую перестройку организма без клинических проявлений. Вслед-

ствие незавершенного фагоцитоза возбудители могут поступать в кровь, распро-

страняясь по всему организму, что соответствует клинически острому периоду бо-

лезни. Из крови бруцеллы захватываются фагоцитами различных органов РЭС

(печень, селезенка, костный мозг и др.) с формированием вторичных метастатиче-

ских очагов инфекции преимущественно в органах опорно-двигательной, нервной и половой систем. Развивается сенсибилизация организма с различными аллерги-

ческими проявлениями. Болезнь принимает хроническое течение со сменой обострений и ремиссий, постепенным затуханием процесса и выздоровлением на длительный период. Инфекция завершается либо полным рассасыванием воспали-

тельных образований, либо формированием стойких необратимых рубцовых из-

менений в пораженных органах и тканях.

Патогенное действие бруцелл обусловлено образованием эндотоксинов, гиа-

луронидазы, каталазы.

Клинические признаки. Инкубационный период 2-3 недели. У коров основ-

ным клиническим признаком бруцеллеза является аборт и реже рождение нежиз-

196

неспособного приплода. Коровы, заразившиеся до покрытия, в большинстве слу-

чаев приносят нормальный приплод. Аборт чаще всего происходит на 5-8-м меся-

це. За 1-2 дня до наступления аборта у коров отмечается припухание наружных половых органов, выделение из влагалища бесцветной или буроватой жидкости и набухание вымени. После аборта происходит задержка последа и развивается эн-

дометрит, сопровождающийся обильными слизисто-гнойными или гнойно-

фибринозными выделениями. При тяжело протекающем эндометрите повышается температура тела, снижаются удои, отмечается потеря веса. Эндометритам неред-

ко сопутствуют серозные или серозно-катаральные маститы. В процессе могут во-

влекаться яичники, что приводит к нарушению полового цикла и временному или стойкому бесплодию.

У отдельных животных можно наблюдать развитие серозных бурситов или серофибринозных артритов на суставах передних конечностей – запястном, путо-

вом, коленном, локтевом. У быков бруцеллез, хотя и редко, сопровождается раз-

витием орхитов и эпидидимитов.

Учеловека возникает утомляемость, раздражительность, головные боли, боли

всуставах и мышцах. Мучительные боли в мышцах и тканях, где образовались метастазы. Радикулиты, поражение половой системы, аборты. Остаточные явле-

ния разнообразны в зависимости от локализации метастазов и в некоторых случа-

ях могут обусловить инвалидность, однако в большинстве случаев наступает пол-

ное выздоровление. При лечении назначают антибиотики, проводят вакцинотера-

пию, физиотерапию и гормонотерапию.

Лабораторная диагностика. Патологический материал: абортированный плод целиком или его перевязанный желудок с содержимым; желудочно-

кишечное содержимое плода; амниотическую жидкость; котиледоны и некротизи-

рованные участки плаценты; вагинальное истечение после аборта или родов,

сперма, а при необходимости и стерильно взятые пробы молока и мочи.

Микроскопия мазков по Граму и Козловскому, посевы на питательные среды.

Выделенные культуры идентифицируют по способности к агглютинации, морфо-

197

логическим и тинкториальным свойствам при помощи методов СО2 и Н2S-

образования.

Биопроба на двух морских свинках – очень чувствительны, предварительно проверяют в РА на отсутствие антител к болезни (п/к). первую свинку убивают через 3 недели, вторую – через 6 недель для бактериологического исследования.

Посевы проводят из лимфатических узлов, селезенки, печени и головного мозга. В

РА исследуют сыворотки крови морских свинок.

Обнаружение титра 1:10 – положительная реакция.

Культуры идентифицируют при помощи РА со специфической бруцеллезной сывороткой, РСК,

непрямой МФА и метода Кумбса на неполные ан-

получения молочной сыворотки к молоку добавляют 1 % сычужного фермента –

1-2 капли на половину пробирки), кольцевую реакцию с молоком (рисунок 119).

РА считается положительной в разведении 1:50 – мелкий рогатый скот, 1:100 -

крупный рогатый скот и 1:10 - собаки.

Аллергическая диагностика. Бруцеллин ВИЭВ. Аллерген вводят подкожно в область нижнего века крупному рогатому скоту – 1 мл; мелкому рогатому скоту и оленям - 0,5 мл. Учет через 48 часов. Свиньям вводят с наружной поверхности уха в дозе 0,2 мл. Учет через 24 и 48 часов. Внутрикожно вводят в подхвостовую складку крупному рогатому скоту – 0,3 мл, мелкому рогатому скоту – 0,2 мл. Учет через 48 часов. Положительный результат – воспаление. Сомнительный - слабо выраженный отек, определяемый пальпацией при сравнении с другой складкой.

Повторное исследование через 20-30 дней.

Дифференцируем от инфекционного эпидидимита баранов - самостоятельно-

го заболевания, вызываемого Brucella ovis, аллерген - бруцеллиноовин.

Иммунитет сначала нестерильный, а затем стерильный (постинфекцион-

ный). В период развития бруцеллезной инфекции в организме вырабатываются

198

антитела, которые постепенно утрачиваются с переходом инфекционного процесса в нестерильную, а затем стерильную фазу иммунитета. Поэтому наличие специфических антител свидетельствует скорее об инфекции, чем об иммунитете.

Специфическая терапия. Животных уничтожают.

Специфическая профилактика. Активная иммунизация против бруцеллеза была начата еще в 1906 г. Бангом. Мировую известность получила вакцина из слабовирулентного штамма B. abortus (штамм № 19), выделенного Буком в 1923 г в вирулентной форме из молока коровы. В процессе десятилетнего пассирования на картофельном агаре культура штамма № 19 спонтанно понизила свою вирулентность.

1. Живая вакцина из штамма № 19 B. abortus против бруцеллеза, создает напряженный иммунитет до 5 лет. Но обладает агглютинабельными свойствами

(дает положительную РА).

2.Вакцина из штамма № 82 B. abortus. Иммунитет до 1 года. Не обладает агглютинабельными свойствами, но обладает абортогенными свойствами.

3.Вакцина из штамма № 82 (ПЧ). Не обладает агглютинабельными и абортогенными свойствами.

4.Живая сухая вакцина из штамма 75/79-АВ ВГНКИ – не обладает побочными свойствами, можно вводить коровам и нетелям независимо от сроков стельности.

5.Вакцина из штамма REV-1 из Brucella melitensis – для овец. Иммунитет до

1 года.

ВОЗБУДИТЕЛЬ ТУЛЯРЕМИИ (Tularemia)

Род Francisella Francisella tularensis

Трансмиссивная природно-очаговая инфекционная болезнь, характеризующаяся септицемией, лихорадкой, поражениями слизистых оболочек верхних дыхательных путей и кишечника, а также нервной системы. Названа по местности Туларе (Tulare) в Калифорнии, где она впервые выделена (Дж. Мак-Кой и Ч. Чепин, 1912) от больных сусликов. К болезни очень чувствителен человек. Сельскохозяй-

199

ственные животные мало чувствительны. Восприимчивы главным образом зайцы,

мыши, водяные крысы, ондатры, бобры, хомяки. Реже овцы, крупный рогатый скот, лошади, свиньи, кролики, домашняя птица, кошки и собаки. Заражение про-

исходит алиментарно, аэрогенно, и при укусах кровососущих членистоногих

(клещей, блох, комаров и т.д.).

Морфология. Мелкая полиморфная грамотри-

цательная палочка (0,2-0,7 мкм), неподвижная,

спор не образует, имеет капсулу (рисунок 120).

Кокки чаще находят в культурах, а палочки - в ор-

будители.

Культуральные свойства. Облигатный аэроб. Для культивирования приме-

няют желточную среду Мак-Коя, состоящую из 60 % желтка куриных яиц и 40 %

физраствора; среду разливают в пробирки и свертывают при 80 °С в течение 1 ч.

Используют также среду Френсиса (2,5 % МПА, 0,1 % цистина, 1 % глюкозы и 5-

10 % дефибринированной кроличьей крови), полужидкую желточную среду Дро-

жевкиной (10% куриного желтка и 90% стерильного физиологического раствора)

и др. На плотных средах: среде Мак-Коя растут в виде блестящего тонкого налета с извилистой («шагреневой») поверхностью, на среде Френсиса небольшие (1-2

мм), круглые, выпуклые, гладкие, блестящие, с ровными краями колонии белова-

того цвета с голубоватым оттенком. Рост - через 2-3 дня. В жидких питательных средах растет значительно хуже (только на поверхности среды). Могут размно-

жаться в желточном мешке куриного эмбриона.

Биохимические свойства. Ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу; не сбраживает лактозу, сахарозу, маннит; образует сероводо-

род.

200