МУ Микробиология Лабораторные

В 1926 г. Маррей открыл возбудителя. Пири выделил возбудителя при септи-

ческом заболевании грызунов с типичным поражением печени и назвал его «ли-

стерелла», но в 1940 г. переименовал на «листерия» в честь Листера.

разует. Подвижен (длинный полярный жгутик).

Культуральные свойства. Аэроб или факультативный анаэроб. Оптимальная температура 31 ºC, психрофил (холодолюбивые), может расти при температуре 4 ºC. Среды обогащают печеночным экс-

трактом, глюкозой, сывороткой, нужны витамины группы В (тиаминозависи-

мые). Рост в течение 1-2 дней. МПБ –

легкое помутнение и слизистый осадок,

поднимающийся при встряхивании в ви- Рисунок 94 - Колонии возбудителя на де косички. МПА – колонии мелкие, но кровяном агаре.

крупнее, чем у возбудителя рожи, круглые, выпуклые, прозрачные, со временем приобретают сероватый оттенок. Вирулентные штаммы образуют S-формы, ави-

рулентные – R-формы. Типичные колонии на плотных средах пересевают для по-

лучения чистой культуры. Кровяной МПА – узкая зона гемолиза. МПЖ – не раз-

жижают (рисунок 94).

Биохимические свойства.Более активен чем бактерии рожи свиней. Фермен-

тирует многие углеводы, в т.ч. салицин. Разлагает глюкозу, левулезу. Образует ка-

талазу. Гемолизирует кровяные среды. Молоко не свертывает. Сероводород не об-

131

разуют. Обесцвечивает индикаторные среды с красками (нейтраль-рот, конго-рот,

метил-рот).

Токсигенность. Листерии выделяют в культуральную жидкость липолитиче-

ский фактор, вызывающий цитолиз культуры макрофагов, и термолабильный ге-

молизин, который в результате активации его цистеином вызывает гемолиз эрит-

роцитов голубя, кролика, морской свинки, лошади. При распаде из микробных клеток выделяется эндотоксин.

Антигенная структура представлена двумя основными серотипами: грызу-

нов и жвачных. Они имеют соматические О- и жгутиковые Н-антигены. О-антиген содержит четыре термолабильных (I, II, IV, V) и вариабельный (III) антигены; Н-

антиген содержит антигены A, B, C и D.

Устойчивость высокая. В почвах - 6 - 11 мес., в навозе - до 7 мес., в силосе -

более года, в мясе - до года. 100 °C – 10-15 мин, 55 °С – 1 ч. Дезсредства: 2,5 %

формальдегид, 2,5 % гидроксид натрия, хлорная известь (2 % активного хлора).

Патогенез. Заражение происходит алиментарно, респираторно и через по-

врежденную кожу. Листерии в организме распространяются гематогенным, лим-

фогенным и нейрогенным путями. Вначале листерии локализуются в лимфатиче-

ских узлах, затем он попадает в кровь и паренхиматозные органы, начиная с 3-его дня после заражения нарушается гематоэнцефалический барьер и листерии про-

никают в ЦНС. Основным местом размножения листерий служит кровь. У взрос-

лых животных при высокой резистентности организма сепсис возникает редко, у

них поражается нервная и половая системы. У молодняка в связи с пониженной сопротивляемостью организма регистрируют сепсис. В некоторых случаях заболе-

вание протекает бессимптомно, при этом животные длительное время остаются носителями листерий.

Клинические признаки. Инкубационный период 7-30 дней. У жвачных чаще наблюдают поражение ЦНС - угнетение, некоординированные, круговые движе-

ния, потеря равновесия, судороги, иногда приступы буйства, парезы отдельных групп мышц, искривление шеи, потеря зрения, конъюнктивиты, стоматиты. Воз-

можно поражение половой системы - аборты, задержание последа, эндометриты.

132

У свиней - исхудание, анемия, снижение аппетита, нарушение координации движений, кашель, абсцессы в различных органах и тканях, посинение кожи в об-

ласти ушей и живота.

У птиц листериоз проявляется как септическое заболевание – потеря аппети-

та, конъюнктивиты, учащение дыхания, слабость, судороги, параличи.

Болезнь чаще заканчивается смертью.

Лабораторная диагностика. Патологический материал: свежие трупы мел-

ких животных; от крупных - голова (головной мозг), паренхиматозные органы; в

случае аборта - абортированный плод и его оболочку, истечения из половых орга-

нов абортировавших самок; также в лабораторию посылают кровь, молоко из по-

раженных долей вымени.

Проводят микроскопию мазков-отпечатков по Граму, на споры и капсулы, и

люминесцентную микроскопию с применением флюоресцирующей сыворотки,

определяют подвижность.

Посевы для выделения культуры производят из всех присланных тканей и ор-

ганов на МПА, МПБ, МППБ, МППА с 1 % глюкозы и 2-3 % глицерина, переваром Мартена.

К листериозу восприимчивы белые мыши, голуби и морские свинки. Зараже-

ние проводят подкожно выделенной культурой или взвесью растертой ткани орга-

нов, присланных в лабораторию. У морских свинок применяют конъюнктиваль-

ную пробу: на конъюнктиву наносят (втирают) 2 капли материала - при положи-

тельной реакции через 2-4 суток развивается кератоконъюнктивит. При подкож-

ной инъекции вводят 0,3-0,5 мл суспензии органов и тканей. При положительной-

биопробе животные гибнут через 2-6 дней. Срок наблюдения за зараженными жи-

вотными не более 8 дней. При вскрытии обнаруживают множественные некроти-

ческие очажки в печени, селезенке, почках. Возможна постановка аллергической пробы: внутрикожно, через 48 часов возникает воспаление с последующим некро-

зом и образованием струпа, гибель лабораторных животных от 2 до 6 дней.

Паренхиматозные органы павших животных исследуют бактериологически.

Выделенную чистую культуру идентифицируют с помощью РА на стекле со спе-

133

цифической антилистериозной сывороткой в разведении 1:50. Антигеном в реак-

ции служит смыв с агара суточной культуры на физиологическом растворе. Серо-

тип идентифицируют при использовании типовых листериозных диагностических агглютинирующих сывороток. Видовую принадлежность возбудителя устанавли-

вают также просматриванием препаратов мазков из культуры или непосредствен-

но из патологического материала, обработанных флуоресцирующей специфиче-

ской сывороткой.

Направляемые в лабораторию сыворотки или пробы крови от животных из хозяйств исследуют в РСК со специфическим антигеном.

Для титрования культур используют листериозные бактериофаги.

Иммунитет формируется.

Специфическая профилактика. Сухая живая вакцина против листериоза сельскохозяйственных животных из штамма АУФ – культура лиофильно высу-

шенного аттенуированного штамма листерий первого серотипа.

Специфическая терапия не разработана.

Контрольные вопросы:

1.Какова морфология возбудителей рожи свиней и листериоза.

2.Показать схему лабораторной диагностики возбудителя рожи свиней.

3.Показать схему лабораторной диагностики листериоза.

4.Каковы особенности температурного режима возбудителя листериоза.

5.Чем объяснить поражение центральной нервной системы при заражении листериозом.

Тема 3.3. Микробиологическая диагностика сибирской язвы.

Цель занятия: ознакомить студентов с возбудителем сибирской язвы, его морфологическими особенностями; изучить источники и механизмы заражения животных и человека; уметь обосновать выбор метода исследования материала,

особенностей его забора и доставки в лабораторию; познакомить студентов с принципами организации микробиологической лаборатории и рабочего места при работе с возбудителями особо опасных инфекций.

134

Содержание:

1.Патологический материал.

2.Микроскопия мазков.

3.Культуральные и биохимические свойства возбудителя.

4.Биологическая проба.

5.Специфическая терапия и профилактика болезни.

6.Некоторые особенности заболевания.

ВОЗБУДИТЕЛЬ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ Род Bacillus

Bacillus anthracis

Anthrax – уголь. Зоонозная остропротекающая инфекционная болезнь, харак-

теризующаяся септицемией и образованием карбункулов. К ней восприимчивы животные многих видов, особенно травоядные, и человек. Распространена повсе-

местно. Сибирская язва, известная с древнейших времен под названиями «свя-

щенный огонь», «персидский огонь» и др., неоднократно упоминалась в сочине-

ниях античных и восточных писателей. Подробное описание клиники этой болез-

ни было сделано французским врачом Мораном в 1766 г. В дореволюционной России была распространена в Сибири. Возбудитель выделен и изучен Брауэлем в

1857 году. Название болезни «сибирская язва» предложил в 1789 г. С. С. Андриев-

ский, который изучал ее на Урале и в Сибири.

Морфология. Крупная палочка 3-10 × 1-1,5 мкм. Грамположительна, непо-

движна, образует споры и капсулы. Капсулы образуются в организме животных уже через 2-3 часа после заражения и может окружать одну или несколько клеток.

Споры образуются в средах с нейтральной, слабощелочной реакцией, при дефици-

те белковых веществ. Спорообразование интенсивнее идет в присутствии кисло-

рода. В условиях лаборатории на питательных средах процессу спорообразования способствует скипидар. При вскрытии трупа наблюдается свободный доступ кис-

лорода → спорообразование → вскрывать трупы запрещено! Споры имеют цен-

тральное расположение, диаметр меньше толщины микробной клетки. Образова-

135

ние спор зависит от температуры окружающей среды. При температуре ниже 12

°С и выше 42 °С, а также в живом организме или невскрытом трупе, в крови и сы-

воротке крови животных споры не образуются. При попадании в благоприятные условия споры начинают прорастать через 5-10 мин.

Из патологического материала клетки располагаются одиночно, парами, ко-

роткими цепочками. В цепочках клетки имеют форму бамбуковых палочек, концы клеток резко обрублены, центральная часть сплющена, концы периферических клеток имеют округлую форму. В мазках из культур клетки располагаются в виде

длинных цепочек.

Формы возбудителя сибирской язвы представлены на рисунке 95.

Рисунок 95 - Формы возбудителя сибирской язвы.

Культуральные свойства. Факультативный анаэроб. Оптимальная темпера-

тура роста 36-38 ºC. Рост быстрый, возбу-

дитель неприхотлив. Растет на МПА, МПБ,

картофельной среде, на плодородных поч-

вах. МПБ – рост через 10-12 часов. Вначале серовато-белые нити, которые к концу ро-

ста оседают на дно, и образуется осадок в

виде комочка ваты. МПА – колонии сред-

ние 3-5 мм, напоминают снежинки (волок-

нистая структура), плоские, шероховатые -

R-форма, серо-белого цвета (рисунок 96). Под малым увеличением микроскопа колонии похожи на гриву льва, голову медузы, локоны волос. МПЖ – при посеве уколом рост в виде перевернутой елочки. Кровяной МПА – гемолиза не дает.

136

Биохимические свойства. Лактоза—, манит —, гемолиз —, молоко +, углеводы

+ с образованием кислоты, но без газа.

Устойчивость. Вегетативная форма микроба в организме разрушается через

2-3 суток в результате воздействия протеолитических ферментов. В замороженном мясе при минус 15 °С - 15 дней, в засоленном мясе - до 1,5 мес. В запаянных ам-

пулах с бульонными культурами - до 63 лет, в почве – около 80 лет. Особенно бла-

гоприятны для длительного сохранения спор почвы, богатые гумусом, с нейтраль-

ным pH. В этих почвах при элективных режимах температуры, влажности и аэра-

ции наблюдается вегетация спор. При 50-55 °С - 1 ч, 60 °С - 15 мин, 75 °С - 1 мин,

кипячение - мгновенно. Низкие температуры консервируют вегетативные клетки.

Бактериостатическим эффектом в течение 24 ч обладает свежевыдоенное молоко коров (чувствительны к лизоциму).

Токсигенность. Бацилла антракса образует сложный экзотоксин, состоящий из трех компонентов (факторов):

- эдематогенный фактор (EF) – липопротеид, вызывает местную воспалитель-

ную реакцию - отек и разрушение тканей;

-протективный антиген (РА) – белок, носитель защитных свойств, обладает выраженным иммуногенным действием. В чистом виде не токсичен;

-летальный фактор (LF) – белок, сам по себе не токсичен, но в смеси с фак-

тором РА вызывает гибель крыс, белых мышей и морских свинок.

Антигенная структура. Два антигена:

- неиммуногенный соматический полисахаридный комплекс С- не создает иммунитета у животных и не определяет агрессивных функций бациллы, его все-

гда обнаруживают как у вирулентных, так и авирулентных штаммов. В связи с тем, что полисахарид тесно связан с телом бактериальной клетки, он получил название соматического антигена;

- капсульный глутамин-полипептид Р - сложный полипептид d-глутаминовой кислоты, дает перекрестные серологические реакции с полипептидом В. subtilis, В. cereus и В. megaterium.

Активными антигенами также являются все три компонентасибиреязвенного

137

экзотоксина.

Патогенез. Бацилла антракса обладает выраженной инвазивностью и легко проникает через поврежденные кожные покровы или слизистые оболочки. Зара-

жение животных происходит преимущественно алиментарно. Возбудитель, попав в организм, быстро размножается, проникая в лимфатические сосуды и в кровь и накапливая токсины. Бацилла антракса синтезирует капсульный полипептид и вы-

деляет экзотоксин, разрушающий фагоциты, поражает центральную нервную си-

стему. Под их действием происходит поражение эндотелия сосудов, повышается их проницаемость, возникают застои, отеки, множественные кровоизлияния, ин-

токсикация, нервные явления и гибель животного.

Клинические признаки. Инкубационный период 1-3 дня. Две основные фор-

мы болезни - септицемическая и карбункулезная. В зависимости от локализации процесс может протекать с преимущественным поражением кожи, кишечника,

легких и глотки. При молниеносном течении длительность болезни - от несколь-

ких минут до нескольких часов. Животное внезапно падает и в судорогах погиба-

ет. У крупного рогатого скота и лошадей отмечают повышение температуры тела до 42 °С, угнетение, отказ от корма, дрожь, нарушение сердечной деятельности,

синюшность видимых слизистых оболочек, на конъюнктиве - точечные кровоиз-

лияния. Длительность течения болезни 2-3 дня. При хронической форме болезнь длится до 2-3 мес.

Возникновение сибиреязвенных карбункулов отмечают на месте первичного внедрения возбудителя или вторично в др. участках тела. Вначале появляется отек кожи и подкожной клетчатки, резко очерченный, твердый, болезненный. Затем он приобретает вид диффузной тестообразной, холодной и безболезненной припух-

лости, центр которой некротизируется и изъязвляется. Поражение кишечника со-

провождается высокой температурой и характеризуется коликами, запором, сме-

няющимся диареей. Легкие в естественных условиях у животных поражаются редко.

У свиней сибирская язва протекает в виде ангины. Воспаление в области глотки сопровождается опуханием шеи, глотание и дыхание затрудняются, появ-

138

ляются кашель, сопение. Нередко у свиней болезнь протекает без выраженных признаков и диагностируется лишь при послеубойномосмотре, т.к. они обладают видовой устойчивостью к возбудителю.

Патологоанатомические изменения. Вскрытие трупов животных подозри-

тельных по заболеванию сибирской язвой, а тем более павших от этой болезни,

категорически запрещается. Однако в практике бывают случаи ошибочного вскрытия трупов, если болезнь протекала с недостаточно выраженными клиниче-

скими признаками. При осмотре трупа обращают внимание на следующие призна-

ки: труп вздут, окоченение отсутствует или слабо выражено, из естественных от-

верстий - кровянистое истечение, на коже - тестоватые припухлости. Кровь тем-

ная, несвернувшаяся. В подкожной клетчатке - инфильтрация и кровоизлияния.

Характерный признак сибирской язвы - резкое увеличение селезенки, консистен-

ция ее дряблая, пульпа на разрезе стекает в виде дегтеобразной массы.

Лабораторная диагностика. Патологический материал: кровь из уха на предметные стекла (толстые нефиксированные мазки крови), в пастеровские пи-

петки, на кусочки сахара или угля. При жизни нужно брать кровь до начала лече-

ния антибиотиками и глобулинотерапии. От трупа берут также кровяные истече-

ния, отрезают ухо с той стороны, на которой лежал труп. Предварительно накла-

дывают лигатуры, место разреза прижигают каленым железом. При вскрытии – кусочки паренхиматозных органов и лимфоузлы. При исследовании кожевенно-

мехового сырья в лабораторию посылают кусочки кожи размером 3×3, 5×5 или

10×10 см.

В лаборатории ухо фиксируют в кювете, подрезают и отпрепаровывают в ви-

де треугольника кожу снаружи уха (там она более подвижна), лоскут кожи отки-

дывают и к подкожной клетчатке прикладывают предметные стекла – готовят маз-

ки-отпечатки. Окрашивают по Граму, на споры и капсулы. Затем подкожную клетчатку измельчают, растирают со стерильным песком и полученную массу ис-

пользуют для посева на питательные среды и для постановки биопробы на мышах.

Диагностика от антракоидов.

1. B. cereus – восковидная;

139

2.B. anthracoides – сибиреязвенноподобная;

3.B. megaterium – капустная;

4.B. mesentericus – картофельная;

5.B. mycoides – корневидная;

6.B. subtillis – сенная.

Сходства:

1.место обитания – почва;

2.одинаковая форма (палочковидная), расположение и размеры;

3.образуют споры – центральное расположение, толщина спор не превышает толщину клеток;

4.имеют общие антигены и могут дать положительную РП.

Отличия:

1. возбудитель сибирской язвы патогенен для многих видов животных, антр-

окоиды не патогенны. Но B. cereus и B. anthracoides могут вызвать гибель мышей;

2. антрокоиды не образуют капсул (но в природе есть бескапсульные вариан-

ты B. anthracis);

3.антрокоиды подвижны, B. anthracis не подвижна;

4.антрокоиды на МПБ образуют пленку или пристеночное кольцо, а B. anthracis осадок в виде комочка ваты;

5.у антрокоидов более выражены протео-

литические и гемолитические свойства, а у B. anthracis слабо;

6. антрокоиды вызывают разжижение же-

латина быстро, а B. anthracis разжижает жела-

тин очень медленно;

7. антрокоиды свертывают желток кури-