МУ Микробиология Лабораторные

В лаборатории проводят простой метод окраски и по Граму (шаровидные клетки располагаются беспорядочно, диаметр 0,5-1,5 мкм, грамположительные),

спор не образуют, капсулу не образуют.

Осуществляют посев на питательные среды (МПА, МПБ, МПА с 15% хлори-

да натрия, кровяной МПА). Выделяют чистую культуру (факультативные анаэро-

бы, оптимальная температура 37°C, срок культивирования 18-20 часов).

Для правильно представления об этиологической роли стафилококков требу-

ется выделить их из исследуемого материала и детально изучить несколько (ино-

гда до 50) колоний, т.к. многие патогенные штаммы не образуют золотистый пиг-

мент и не вызывают гемолиз на кровяном агаре при обычных условиях. С этой це-

лью чистые культуры стафилококков проверяют по их способности ферментиро-

вать маннит, коагулировать цитратную плазму, выделять фибринолизин и лецити-

назу, ДНКазу, обладать скрытой (потенциальной) гемолитической активностью.

Для полной характеристики патогенных штаммов определяют у них способность

выделять дермонекротоксин, токсин общего дей-

ствия и энтеротоксин.

Ферментацию маннита стафилококками определяют путем посева на МПБ, содержащим

0,5 % маннита, индикатор Андрэдэ и газовые по-

плавки в течение 24-48 ч при 37 °С – среда красне-

ет, в газовых поплавках иногда скапливаются пу-

зырьки воздуха.

Образуют каталазу. Проба на стекле – в 1

каплю 0,5 % перекиси водорода вносят микробную

Стафилококки исследуют в реакцииплазмокоагуляции (РПК). Для постановки необходимы молодые культуры стафилококков; для контроля – заведомо коагули-

рующий и некоагулирующий штаммы микробов, нитратная плазма кролика. Кровь

111

берут из сердца кролика в объеме 8 мл иглой, надетой на шприц, промытый 5 %

раствором цитрата натрия. Ее осторожно сливают в пробирку с содержанием 2 мл

5 % цитрата натрия и перемешивают. Кролику же вводят подкожно 8 мл стериль-

ного физиологического раствора. Пробирку с цитратной кровью выдерживают при

4 °С до осаждения эритроцитов либо для ускорения процесса центрифугируют

(надосадочная жидкость и будет плазма). Срок хранения такой плазмы в холо-

дильнике составляет 4-5 дней. Берут необходимое количество плазмы и разводят

1:5, разливают в пробирки по 0,5 мл и соединяют с 0,5 мл бульонной культуры.

Пробирку встряхивают и помещают в термостат при 37 °С. Учитывают результат через 1, 2, 3 и 24 часа. Наличие сгустка в плазме (сворачивание) указывает на по-

ложительный результат реакции. При отрицательном результате плазма остается жидкой (рисунок 84). Для признания штамма патогенным срок наступления реак-

ции значения не имеет.

Для выявления фибринолитической активности стафилококков пробирки с положительными результатами плазмокоагуляции оставляют в термостате на не-

сколько дней. При наличии фибринолизина коагулированная плазма разжижается.

Способность стафилококков продуцироватьлецитиназу определяют добавле-

нием к расплавленному и охлажденному до

50-60 °С МПА взбитых яичных желтков, по-

сле чего среду тщательно перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания среды проводят посев исследуемых культур.

При росте на этой среде лецитиназоположи-

тельные штаммы стафилококков через 24-48

Рисунок 85 - Реакция гемолиза на

ч. Образуют вокруг колоний зону помутне- стафилококки. ния, окруженную радужным венчиком.

Скрытую (потенциальную) гемолитическую способность стафилококков вы-

являют на 5 % кровяном МПА (рисунок 85). Бактериологической петлей по диа-

метру чашки делают прямой полоской посев β-гемолитического штамма стрепто-

кокка. Затем перпендикулярно этой полоске с двух сторон высевают по 4-5 иссле-

112

дуемых штаммов стафилококков. После суточного инкубирования при 37 °С неко-

торые негемолитические штаммы в непосредственной близости к β-

гемолитическому штамму стрептококков образуют зону четко выраженного гемо-

лиза.

Для выявления ДНКазной активности стафилококков к расплавленному и охлажденному МПА (рН 8,4-8,6) добавляют раствор натриевой соли ДНК и сте-

рилизуют на водяной бане 30-40 минут. После охлаждения среды до 50-60 °С к ней асептично добавляют хлорид кальция и разливают по чашкам Петри. На по-

верхность застывшей среды высевают в заранее размеченные точки 8-10 исследу-

емых культур стафилококка и инкубируют при 18-20 ч при 37 °С. Затем в чашку вносят 4-5 мл 1 н раствора соляной кислоты, которую через 2-3 мин сливают.

Чашки просматривают на проходящем рассеянном свете. ДНК под воздействием соляной кислоты выпадает в серо-белый осадок (среда непрозрачная серо-белого цвета). ДНКаза вызывает распад ДНК и осадок не выпадает – агар остается про-

зрачным. По наличию просвечивающих зон вокруг колоний на непрозрачном,

мутном серо-белом фоне всего слоя агара делают вывод: культура стафилококка продуцирует ДНКазу.

При необходимости выявляют летальные свойства исследуемой культуры стафилококков на кроликах (дерматонекротическая проба) – внутрикожно кроли-

ку вводят 0,2 мл культуры (возникает некроз).

Фаготипируют выделенные культуры с помощью стафилококковых фагов.

Энтеротоксины в пищевых продуктах и культурах определяют в РДП со стафило-

кокковыми антисыворотками к энтеротоксинам А, B, C, D, E, F.

Серологическая и аллергическая диагностика в ветеринарии не используется.

В связи с широким распространением штаммов, резистентных к лекарствен-

ным препаратам, проводят определение чувствительности выделенных культур к антибиотикам (чашечный метод), что очень важно для назначения рациональной антибиотикотерапии.

Иммунитет. Здоровые животные обладают естественной резистентностью к стафилококковой инфекции (обусловлена барьерной функцией кожи и слизистых

113

оболочек, фагоцитозом и наличием специфических антител, образуемых в резуль-

тате скрытой иммунизации).

Иммунитет при стафилококковых инфекциях антитоксический, слабой напряженности и непродолжительный, что обусловливает частые рецидивы.

Специфическая терапия и профилактика.

1.Очищенный стафилококковый анатоксин и аутовакцина – смыв агаровой культуры стафилококка, прогретого 1-1,5 часа при 75 ºС.

2.Стафилококковый антивирус - фильтрат 2-3 недельной бульонной культу-

ры стафилококка и взвесь стафилококкового бактериофага.

ПАТОГЕННЫЕ СТРЕПТОКОККИ Род Streptococcus (цепочка)

По классификации Берджи стрептококки подразделяют на три группы:

1. Гноеродные гемолитические: Str. pyogenes (возбудитель различных гнойно-

воспалительных процессов – абсцессов, флегмон, сепсиса); Str. agalactiae (mastitidis) - возбудитель инфекционного мастита коров; Str. equi – возбудитель мыта лошадей;

2.Зеленящие стрептококки - Str. viridans;

3.Молочнокислые стрептококки - Str. lactis; Str. cremoris.

Впервые описал Л. Пастер в 1880 г. Чистую культуру стрептококков выделил Ро-

зенбах в1884 г. Патогенные стрептококки заселяют слизистые оболочки, кожу и проявляют свою патогенность при снижении общей резистентности. В естествен-

ных условиях стрептококки являются возбудителями болезней крупного рогатого скота и лошадей, а также нагноительных процессов. Фекальные стрептококки мо-

гут вызвать воспаление кишечника и мочеполовых путей, а также пищевые ток-

сикозы (токсикоинфекции).

Антигенная структура. В основе современной классификации положен принцип антигенной структуры микроба. По группоспецифическим полисахарид-

ным антигенам Лансфилд разделила стрептококки на 17 серогрупп, которые обо-

114

значают латинскими буквами в порядке алфавита. Антиген, позволяющий опреде-

лить серогруппу, представляет собой полисахарид клеточной стенки.

Факторы патогенности. Экзотоксины: гемолизин (разрушает эритроциты,

лейкоциты, тромбоциты, макрофаги); лейкоцидин (разрушает лейкоциты); некро-

токсин (при внутрикожном введении кролику вызывает некрозы). Продуцируют

термостабильные эндотоксины.

Ферменты: гиалуронидаза, фибринолизин, дезоксирибонуклеаза, рибонукле-

аза, нейраминидаза, протеиназа, стрептокиназа, амилаза, липаза.

ВОЗБУДИТЕЛЬ МЫТА ЛОШАДЕЙ

Streptococcus equi

Мыт – острая контагиозная инфекционная болезнь в основном молодых ло-

шадей (до 2-х лет), проявляющаяся гнойно-катаральным воспалением слизистой

оболочки носоглотки и абсцедированием подчелюстных лимфатических узлов.

Возбудителя открыл и изучил Щутц в

1888 году.

Морфология. Мытный стрептококк,

обнаруживают в гное в виде длинных из-

витых цепочек, клетки (1 мкм) сплюснуты в поперечном направлении, напоминают форму палисада (частокол), в длину до 60

клеток. Из культур располагаются оди-

Культуральные свойства. Факультативный анаэроб. Оптимальная темпера-

тура – 37 – 38 ºC. На обычных средах не растет. Элективные среды: глюкозо-

сывороточный бульон и агар. Рост быстрый - в течение первых суток. Глюкозо-

сывороточный бульон – слабое умеренное помутнение, при хранении пылевидный или мелкозернистый осадок, слизистый. Глюкозо-сывороточный агар – в первые

115

сутки мелкие, прозрачные, круглые, выпуклые, однородные колонии. Со временем колонии приобретают сероватую окраску. Это S–форма, при старении могут при-

нимать R–форму (слизистые). На свернутой кровяной сыворотке мытный стрепто-

кокк растет в виде стекловидных сероватых колоний. На кровяном агаре - мелкие колонии с зоной β-гемолиза.

Биохимические свойства выражены слабо. Не образуют каталазу. В отличие от гноеродных стрептококков мытный не ферментирует лактозу, манит; инулин не разлагает, простое молоко не свертывает, лакмусовое и метиленовое молоко не обесцвечивает. Гемолизирует кровяные среды (сапрофиты гемолиза не дают).

Устойчивость. В гное – не менее года, в волосяном покрове лошади – до 3

недель, в навозе - месяц, в воде – до 9 недель, устойчив к замораживанию. Сол-

нечные лучи – до 8 часов, 70 °С - 1 ч, 85 °С - 30 мин. Дезсредства: 1 % формалин, 3 % гидроксид натрия.

Патогенность. Болеют однокопытные (лошади, ослы, мулы, лошаки). Чаще в возрасте от 6 мес. до 5 лет. Установлено внутриутробное заражение плода через плаценту. В этом случае рождаются жеребята, больные мытом. Возбудитель, вы-

деленный из гноя, вирулентен для жеребят, но культуры данного стрептококка,

свежевыделенные агаре, авирулентны.

Патогенез. Возбудитель проникает через слизистую оболочку носоглотки в лимфатические узлы. Микроб и его токсины вызывают серозно-катаральное,

гнойное воспаление слизистой оболочки. Воспаленные подчелюстные лимфоузлы увеличиваются, абсцедируют и вскрываются. При доброкачественной форме вос-

паления исчезают, истечения прекращаются, температура нормализуется. Полости абсцесса рубцуются, наступает выздоровление. При злокачественном течении возникают гнойные воспаления. Гематогенным путем возбудитель может проник-

нуть в различные органы и вызвать гибель.

Клинические признаки. Инкубационный период – до 12 дней. Течение бо-

лезни, как правило, острое. Лихорадка, угнетение, вялость, лошадь вытягивает шею, прием корма затруднен. Абсцессы вскрываются наружу и животное выздо-

равливает. Болезнь длится 2-3 недели (рисунок 87). При осложненной форме гной

116

может попадать в легкие и вызывать гнойную бронхопневмонию. Занос стрепто-

кокка в суставы обуславливает развитие артритов. Болезнь может закончиться ги-

белью животного.

Рисунок 87 – Клинические признаки мыта лошадей.

Лабораторная диагностика. Патологический материал: истечения из носа,

гнойный экссудат или пунктат подчелюстных лимфоузлов.

Проводят микроскопию мазков из патологического материала – тонким сло-

ем, фиксируют, окрашивают по Граму и Романовскому-Гимза.

Посевы на питательные среды для выделения чистой культуры и ее иденти-

фикации: делают посев на глюкозно-сывороточный агар (24 часа) – мытный стрептококк образует мелкие, просвечивающиеся, похожие на капельки росы,

сливающиеся между собой колонии.

Для биопробы используют котят, которые гибнут от ничтожно малой дозы бульонной культуры при подкожном или внутрибрюшинном заражении в течение

3-10 дней. Выделенную культуру можно идентифицировать с помощью мытного антивируса, который представляет собой фильтрат 20-суточной бульонной куль-

туры мытного стрептококка. В фильтрате мытный стрептококк не растет, а другие виды стрептококков (например, гноеродные) растут.

При атипичной форме мыта лошадей можно применять РСК с мытным анти-

геном.

Иммунитет стойкий длительный. У неболевших лошадей с течением вре-

мени может возникнуть невосприимчивость к мыту в результате длительной

117

скрытой иммунизации стрептококками, находящимися на слизистой оболочке но-

соглотки.

Специфическая терапия. Мытный антивирус – фильтрат 3-х недельной культуры Streptococcus equi, выращенный на глюкозо-сывороточном бульоне и консервированный карболовой кислотой. Применяется внутримышечно, для про-

мывания полостей, абсцессов, можно обкалывать абсцессы.

ВОЗБУДИТЕЛЬ СТРЕПТОКОККОЗА МОЛОДНЯКА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Streptococcuspneumoniae

Старое название: диплококковая септицемия, диплококкоз, диплококковая

инфекция. Это инфекционное заболевание преимущественно молодняка сельско-

хозяйственных животных, пушных зверей, характеризующееся сепсисом, энтери-

том, пневмонией и поражением суставов. Возбудитель стрептококкоза впервые был обнаружен в 1871 г. Л. Пастером в слюне ребенка, погибшего от бешенства. В

чистой культуре пневмококки выделил в 1886 г. Френкель, который установили роль пневмококка в этиологии крупозной пневмонии.

на сывороточном или кровяном агаре).

Культуральные свойства. Факультативный анаэроб. Оптимальная темпера-

тура 37-38 ºC, рост на средах, обогащенных глюкозой (0,5-3 %) и сывороткой. Рост

118

в течение 1-2-х суток. МПБ – слабое помутнение, пылевидный осадок, в старых культурах осадок слизистый, поднимается в виде косички. Глюкозо-

сывороточный агар – мелкие, прозрачные, круглые, выпуклые с голубым оттен-

ком колонии, β-гемолиз. При старении колонии приобретают сероватый оттенок.

Это S-формы колоний, типичные вирулентные. МПЖ не разжижает.

Биохимические свойства. Ферментирует глюкозу, инулин (многоатомный спирт из клубней картофеля), мальтозу, лактозу, сахарозу, молоко свертывает. β-

гемолиз. Растворяется в желчи - в желчный глюкозо-сывороточный бульон (10 %

желчи) добавляют 0,5-0,7 мл суточной бульонной культуры пневмококка и поме-

щают в термостат на 1-4 часа. Параллельно засевают в аналогичном бульоне без желчи. В желчи Str. pneumoniae растворяется и бульон прозрачный, в отличие от других стрептококков. Индол не образует.

Патогенез. При внедрении в слизистую оболочку дыхательных путей, пище-

варительного тракта, матки или вымени вирулентные диплококки продуцируют токсины, тормозящие фагоцитоз. Капсульные диплококки противостоят разруши-

тельному действию фагоцитарных ферментов. Будучи поглощенными фагоцита-

ми, диплококки не погибают, а наоборот, вызывают гибель поглотивших их лим-

фоцитов. Токсины обуславливают увеличение проницаемости стенок сосудов,

возникают отечность и кровоизлияния. Ткани перерождаются, особенно в печени,

сердце и почках. Развивается септицемия и новорожденные животные погибают.

При своевременном лечении или достаточном уровне иммунитета явления токси-

коза и септицемии купируются, и животные выздоравливают, приобретая имму-

нитет. После переболевания в молодом возрасте животные могут длительное вре-

мя оставаться скрытыми носителями диплококковой инфекции. Вследствие ослаб-

ления устойчивости организма диплококки размножаются, обуславливая эндомет-

рит и мастит.

Клинические признаки. Инкубационный период – до 5 дней. При остром те-

чении повышена температура тела, слизистая оболочка носа и конъюнктивы гипе-

ремированы, слезотечение, пневмонии, энтериты. Через 1-2 дня животное может

119

погибнуть. При хроническом течении воспаляются суставы и поражаются органы дыхания – болезненный кашель, обильное (вплоть до гнойного) истечение из носа.

Устойчивость.85 °С - 30 мин. Во внешней среде погибает через 3-4 недели.

Чувствительны к действию солнечных лучей и высушиванию. Дезсредства: 1 %

формалин, 2 % гидроксид натрия, хлорную известь. Пневмококки легко подвер-

гаются аутолизу вследствие высокой активности их внутриклеточных ферментов.

Патогенность. Пневмококки – постоянные обитатели слизистых оболочек органов дыхания и пищеварения, иногда вымени. После тяжелых родов у коров,

свиней, овец он вызывает мастит, эндометрит, у новорожденного молодняка – септицемию, пневмонии, энтерит. Чувствителен молодняк обычно в первые 1,5-2

мес. С возрастом заболевание встречается реже. Из лабораторных животных чув-

ствительны белые мыши, кролики; морские свинки – устойчивы. У людей – кру-

позная пневмония. Сегодня известно 84 серовара и в зависимости от него намеча-

ются признаки. Гибель лабораторных животных через 2-3 суток. Пневмококки ви-

рулентны из патологического материала, из культур авирулентны, заражение жи-

вотных только патологическим материалом.

Лабораторная диагностика.Патологический материал: выделения из поло-

вых органов, свежие трупы, паренхиматозные органы, трубчатые кости, сердце с кровью, кровь в запаянных пипетках, головной мозг.

Проводят микроскопию мазков, посевы. Для выделения чистой культуры за-

ражают белых мышей тканевой суспензией внутрибрюшинно. После гибели мы-

шей из крови сердца делают посевы, мазки. Стрептококковые антигены в крови выявляют в РСК с иммунными кроличьими сыворотками.

Для типизации пневмококков используют РА и МФА.

Для прижизненной диагностики используют метод получения гемокультур.

Для этого у больных животных берут кровь и засевают в пробирки с полужидким агаром на 2 дня при 37 °C. Затем делают высев на кровяной агар и выращивают еще сутки.При положительном результате на кровяном агаре вырастают колонии,

окруженные зоной гемолиза, а в мазках обнаруживают стрептококки.

120