МУ Микробиология Лабораторные

II.Гемолитическая система

2.Гемолитическая сыворотка – гемолизин – сыворотка кролика, гиперимму-

низированная эритроцитами барана, содержащая антитела к этим эритроцитам.

Для этого кролику 4-5 раз с интервалом 2-3 дня вводят эритроциты барана, после последней инъекции берут сыворотку и используют. Гемолизин выпускают в жид-

ком и или сухом виде. Гемолизин обладает свойством лизировать эритроциты ба-

рана, но только в присутствии комплемента.

3. Эритроциты барана являются антигеном для гемолизина в гемолитиче-

ской системе.

Кровь от барана получают в стерильный флакон, дефибринируют стеклянны-

ми или фарфоровыми бусами, продолжая встряхивать еще 10 минут после крово-

пускания. Фильтруют, центрифугируют 10-15 минут. Отмывают эритроциты не менее 3 раз, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. Из осадка готовят

2,5 % взвесь эритроцитов, которую и используют для постановки РСК.

Реакцию ставят в строго определенной последовательности: сначала вносят компоненты баксиситемы (антиген + антитело + комплемент) и помещают на во-

Рисунок 76 - РСК (принцип).

91

дяную баню при 37 °С на 20 минут, затем вносят гемолитическую систему (гемо-

лизин + эритроциты барана) и повторно помещают на водяную баню при 37-38 °С

на 20 минут. Компоненты реакции перед постановкой РСК титруют и вносят в про-

бирки в объеме 0,2 мл.

Результаты РСК оцениваются по пяти бальной шкале (рисунок 77):

++++ -полная задержка гемолиза;

+++ - значительная, но неполная за-

держка гемолиза;

++ - частичная задержка гемолиза;

Рисунок 77 - Результаты РСК.

+ - значительная задержка гемолиза;

- полный гемолиз.

4 и 3 креста - положительный результат; 2 креста - сомнительный, 1 крест и отсутствие крестов - отрицательный.

Предварительный учет проводят по истечении срока выдержки на водяной бане, окончательный – через 18 – 20 часов.

Реакция длительного связывания комплемента (РДСК). Бактериолитиче-

скую систему выдерживают при трех различных температурных режимах: после смешивания компонентов – при комнатной температуре 15 мин., затем на холоде

4 С 20 часов и на водяной бане 15 мин. затем добавляют гемолитическую систему,

помещают на водяную баню и проводят учет реакции. Считается более эффектив-

ной, чем РСК.

Контрольные вопросы:

1.Перечислить компоненты РСК.

2.Какие требования необходимо соблюдать при постановке реакции.

3.Что входит в состав бактериологической системы.

4.Что происходит в бактериологической системе при положительной реак-

ции.

92

5. Учет и оценка РСК.

Тема 2.4. Серологические реакции с использованием меченных антител и

антигенов. РН

Цель занятия: изучить РН для видовой принадлежности бактерийных токси-

нов в исследуемом материале и установление активности антитоксических сыво-

роток; изучить МФА для обнаружения бактерий в патологическом материале,

объектах внеш-

ней среды, а

также для иден-

тификации воз-

будителей забо-

леваний в куль-

турах; изучить ИФА для выяв-

ления микроор-

ганизмов и ан-

тител к ним.

Содержа-

соединяют равные объемы сыворотки крови и бактериальной взвеси, и после вы-

держки определяют, сохранился ли в смеси возбудитель путем заражения смесью,

чувствительной к взятому антигену живой системы (биопроба на тест-объектах) (рисунок 78).

93

Отсутствие действия возбудителя на тест-объект (отрицательная биопроба)

при положительном контроле расценивается как свидетельство нейтрализации биологической активности антигена антителами сыворотки и, следовательно, го-

мологичности антител сыворотки и антигенов возбудителя. В случае же положи-

тельной биопробы считают, что нейтрализации не произошло, т.к. сыворотка не содержит антител к взятому возбудителю.

Метод флуоресцирующих антител. При постановке данной реакции ис-

пользуют люминесцентный микроскоп (рисунок 79).

Рисунок 79 - Люминесцентный микроскоп.

Антитела, соединенные с флуорохромом, сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс анти-

ген + антитело обнаруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению благодаря присутствию в нем флуорохрома.

Для получения антител используют высокоактивные гипериммунные проти-

вовирусные сыворотки, максимально освобожденные от гетероантител. Из таких

94

сывороток выделяют гомогенные фракции, содержащие антитела, которые метят флуорохромом. Антитела, меченные флуорохромом, называют конъюгатом.

Используют мазки, отпечатки, гистосрезы и культуры клеток.

Мазки готовят из смывов и других жидкостей. Мазки-отпечатки готовят из тех органов и тканей, в которых предполагается наибольшая концентрация возбудите-

ля. Из органов готовят отпечатки, прикладывая быстрым движением предметное стекло к поверхности органа. Отпечаток должен быть тонким и равномерным.

Мазки-отпечатки подсушивают на воздухе, затем фиксируют и сохраняют в холодильнике до исследования (при минус 4 °С, минус 70 °С).

Для контроля таким же образом готовят препараты из органов здоровых жи-

вотных.

Непосредственно на препарат наносят конъюгат и выдерживают в те-

чение 20-60 мин при температуре 37 °С

во влажной камере, некоторые исследо-

ватели предпочитают проводить эту процедуру при 4 °С, удлиняя время.

Препараты отмывают физиологическим раствором (рН 7,2-7,5) от не связанно-

го с антигеном конъюгата. Затем их

Рисунок 80 - Свечение вируса при РИФ.

подсушивают на воздухе, наносят не-

флуоресцирующее масло и исследуют под микроскопом.

Результаты учитывают по интенсивности и специфичности флуоресценции ис-

следуемого объекта с учетом структурных особенностей по следующей шкале (ри-

сунок 80):

(++++) - яркая, сверкающая флуоресценция изумрудно-зеленого цвета;

(+++) - яркая флуоресценция зеленого цвета;

(++) - слабая флуоресценция желтовато-зеленого цвета;

(+) - очень слабая флуоресценция неопределенного цвета;

(-) - объект не флуоресцирует.

95

Иммуноферментный анализ. Это методы, основанные на использовании в каче-

стве метки антигенов и антител ферментов. ИФАаналогична МФА, но отличается тем, что для постановки реакции используют антитела, меченные не флуорохро-

мом, а ферментом, и учет результатов реакции проводят не под люминесцентным микроскопом, а под обычным световым.

При выявлении антигена с помощью этого метода используют конъюгаты,

полученные из антител, выделенные из специфической сыворотки, и фермент. На мазок наносят 0,2-0,3 мл иммунопероксидазного конъюгата. Инкубируют 1-2 ч при

37 °С во влажной камере. Препарат в течение 15 мин тщательно промывают фи-

зиологическим раствором, споласкивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Наносят на него несколько капель раствора субстрата, инкубируют 5-10

мин и промывают 10-15 мин в физиологическом растворе, споласкивают дистилли-

рованной водой.

В положительных случаях, т.е. при наличии антигена в исследуемом препара-

те, после нанесения иммунопероксидазного конъюгата образуется комплекс анти-

ген-антитело, меченный ферментом. После нанесения на препарат раствора суб-

страта последний под действием фермента разлагается, образуя цветной продукт ферментативной реакции, хорошо видный в световом микроскопе.Результаты учи-

тывают с помощью светового микроскопа. Субстрат под действием фермента раз-

лагается, образуя продукт реакции голубого цвета, который быстро переходит в ко-

ричневый. В препарате видны или диффузное желто-коричневое окрашивание, или гранулы коричнево-черного цвета. В контрольных препаратах окрашивания не об-

наруживают.

Контрольные вопросы:

1.В чем сущность иммунологических методов диагностики.

2.Что принимают за единицу антитоксической сыворотки.

3.Какие существуют флуоресцентные методы.

4.На чем основан прямой метод.

5.На чем основан непрямой метод.

6.Что положено в основу иммуноферментного анализа.

96

Тема 2.5. Коллоквиум № 3 «Инфекция и иммунитет»

Цель занятия: проверить остаточные знания студентов по пройденному материалу.

Содержание:

1.Вопросы к коллоквиуму №3 «Инфекция и иммунитет»:

классификация и строение антител;

антигены бактериальной клетки;

виды иммунитета;

иммунологическая память;

реакция агглютинации;

реакция преципитации;

реакция связывания комплемента;

формы инфекции.

Тема 2.6. Отбор, консервирование, транспортировка и хранение матери-

ала для бактериологического исследования.

Цель занятия: ознакомить студентов с методами консервирования, отбора,

транспортировки и хранения материала для бактериологического исследования.

Содержание:

1.Методы лабораторных исследований.

2.Отбор патологического материала.

3.Правила взятия, консервирования и транспортировки патологического материала.

Схема диагностики инфекционных болезней

Диагноз на инфекционные болезни ставят комплексно, учитывая эпизоотологические данные, клинические признаки болезни, результаты аллергической диагностики, патологоанатомические изменения в органах и результаты лабораторных исследований.

97

Методы лабораторных исследований

При лабораторной диагностике исследуемого материала на инфекционные болезни используют бактериологический, серологический и молекулярно-

генетический методы.

Бактериологический метод включает:

- бактериоскопический - применяют с целью изучения морфологических осо-

бенностей микроорганизмов (формы, размера, особенностей внутренней структу-

ры, расположения в мазках, подвижности, наличии спор и капсул) их тинктори-

альных свойств (способности воспринимать ту или иную окраску, отношения к растворам спиртов, кислот, щелочей);

- собственно бактериологический - из патматериала выделяют чистую куль-

туру возбудителя и изучают ее культурально-биохимические свойства;

- биологический (биопроба) – определяют патогенные свойства выделенных культур микробов путем заражения лабораторных животных.

Серологический метод – выявляют специфические антитела в сыворотке крови больных или иммунизированных животных, используя заведомо известный

(биофабричный) антиген, или определяют наличие неизвестного антигена с по-

мощью известных диагностических иммунных сывороток. Можно определить вид и тип микроорганизма, выделенного из патматериала.

Молекулярно-генетический – использование ПЦР и ДНК-зондов.

Отбор патматериала

Для определения или подтверждения причины болезни или гибели животного исследуемый материал отправляют в ветеринарную лабораторию. При отборе ма-

териала из органов его поверхность прижигают распаленным шпателем и делают разрез стерильным скальпелем. С поверхности разреза берут материал пастеров-

ской пипеткой или бактериологической петлей и тонким слоем наносят на пред-

метное стекло. Из тканей органов делают мазки-отпечатки. С этой целью стериль-

ными ножницами (скальпелем) вырезают небольшой кусочек, берут его пинцетом и легким прикосновением к чистому и обезжиренному предметному стеклу дела-

ют несколько отпечатков.

98

При отборе гноя или мокроты пастеровской пипеткой или бактериологиче-

ской петлей исследуемый материал наносят на предметное стекло, накрывают другим предметным стеклом, раздавливают и разводят в разные стороны, получая при этом два мазка.

При отборе крови на предметное стекло, ближе к одному из краев, наносят каплю крови. Шлифованным предметным стеклом под углом в 45 ° делают сколь-

зящее движение, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхно-

сти стекла.

Образцы материала для микробиологического исследования следует забирать до назначения антимикробной терапии, с соблюдением правил асептики для пре-

дупреждения загрязнения материала. Каждый образец следует рассматривать как потенциально опасный. При заборе, транспортировке, хранении и работе с ним необходимо соблюдать правила биологической безопасности. Материал собирают в объёме, достаточном для всего комплекса исследований. Микробиологические исследования следует начинать немедленно после поступления образца в лабора-

торию.

Принципы организации и

оборудование бактериологических лабораторий

В бактериологических лабораториях проводят исследование патологического материала с целью диагностики инфекционных болезней на туберкулез, бруцел-

лез, сибирскую язву, рожу свиней и др.

В каждой лаборатории должны быть предусмотрены:

1) боксы для работы с отдельными группами бактерий или вирусов;

2) помещения для серологических исследований, приготовления питательных сред, стерилизации и мойки посуды; виварий с отдельными боксами для здоровых и подопытных животных.

В бактериологической лаборатории должно быть оборудовано место для окраски микроскопических препаратов с набором анилиновых красителей, реак-

тивов, спиртовок, сливных чаш, фильтровальной бумаги, банок с дезинфицирую-

щим раствором и т. д.

99

Правила взятия, консервирования и транспортировки патологического

материала

При отборе и обработке патологического материала для пересылки в лабора-

торию необходимо придерживаться следующих правил:

учитывать патогенез болезни и тропизм возбудителя;

использовать стерильные инструменты и посуду;

доставлять его в максимально сжатые сроки;

отбирать материал до начала лечения антимикробными препаратами.

В лабораторию могут быть направлены:

- для прижизненной диагностики: кровь, сыворотка крови, кал, моча, молоко,

экссудаты, гной, соскобы с кожи и др.;

- для посмертной диагностики: паренхиматозные органы, лимфоузлы, мыш-

цы, сердце целиком с кровью, головной мозг, трубчатая кость, абортированный плод и др.;

- пробы из объектов внешней среды: воды, почвы, фуража; клещи, насекомые,

грызуны и др.

Трупы мелких животных, а также поросят, ягнят, телят лучше посылать цели-

ком во влагонепроницаемой таре.

Трубчатые кости, посылаемые на исследование, должны быть целыми, с не-

поврежденными концами, обернутыми в марлю или полотно, смоченное дезинфи-

цирующей жидкостью (5 %-ным раствором карболовой кислоты).

Кровь берут в пробирки или колбы из яремной вены с соблюдением стериль-

ности. Кал берут из прямой кишки стеклянной трубочкой с оплавленными краями,

один конец трубочки закрывают ватно-марлевой пробкой. После взятия кала труб-

ку опускают в пробирку с физиологическим раствором. Мочу у животных берут с помощью катетера.

Перед отбором молока сосок вымени дезинфицируют 70 % спиртом, сдаива-

ют 100-150 мл молока в банку с дезраствором, а последующие порции в количе-

стве 30 мл - в стерильные сосуды.

100