МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

«РЯЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ П.А. КОСТЫЧЕВА»

(ФГБОУ ВО РГАТУ)

ФАКУЛЬТЕТ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ

Вологжанина Е. А., Льгова И. П., Ломова Ю. В.

МИКРОБИОЛОГИЯ

УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ

для лабораторной работы по учебной дисциплине Б1.В.13 «Ветеринарная санитария»

по направлению подготовки (специальность): 36.03.01 Ветеринарно-санитарная экспертиза направленность (профиль) программы: «Ветеринарно-санитарная экспертиза»

Рязань

2019

Учебно-методическое пособие для лабораторных работ составлено с учетом требований федерального государственного образовательного стандарта высшего образования по направлению подготовки 36.03.01 Ветеринарно-санитарная экспертиза, утвержденного приказом Минобрнауки России от 19.09.2017 г. № 939.

Обсуждены и одобрены на заседании кафедры эпизоотологии, микробиологии и паразитологии, протокол № 1 от 28 августа 2019 г.

Обсуждены и рекомендованы к печати на заседании учебно-методической комиссией факультета ветеринарной медицины и биотехнологии, протокол № 1 от ___ августа 2019 г.

2

5

ВВЕДЕНИЕ

Основной целью изучения дисциплины является формирование научного ми-

ровоззрения о многообразии микроорганизмов, их роли в общебиологическом процессе, возникновении инфекционных болезней животных; освоение принципов и методов микробиологической диагностики и специфической профилактики бо-

лезней инфекционной природы с целью использования полученных знаний в практической деятельности.

Задачи учебной дисциплины:

1. Изучение морфологии, физиологии, генетики, экологии, принципов систе-

матики микроорганизмов;

2.Изучение основ учения об инфекции и иммунитете;

3.Изучение свойств возбудителей болезней бактериальной и грибной этиоло-

гии;

4. Изучение основ микробиологической диагностики и специфической про-

филактики наиболее значимых инфекционных болезней.

Таблица 1 – Перечень основных задач профессиональной деятельности выпу-

скников (по типам):

Дисциплина «Микробиология» является предшествующей для освоения таких дисциплин как «Патологическая анатомия животных», «Инфекционные болезни», «Санитарная микробиология», «Ветеринарная санитария», «Ветеринарно-

санитарная экспертиза».

Область профессиональной деятельности (по Реестру Минтруда):

-13 Сельское хозяйство;

-01 Образование и наука.

Объекты профессиональной деятельности выпускников:

- все виды сельскохозяйственных животных; технологические процессы производ-

ства продукции животноводства и растениеводства; корма и кормовые добавки;

- журналы учета и документы отчетности, трудовое законодательство, орга-

низация ветеринарного дела.

8

ТЕМЫ ЛАБОРАТОРНЫХ ЗАНЯТИЙ

РАЗДЕЛ 1. ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Тема 1.1. Техника безопасности. Бактериологическая лаборатория. Уст-

ройство микроскопа

Цель занятия: ознакомить студентов с техникой безопасности и правилам ра-

боты в бактериологической лаборатории; изучить оборудование бактериологиче-

ской лаборатории; изучить устройство светового микроскопа и правила микроско-

пирования.

Содержание:

1.Техника безопасности

2.Бактериологическая лаборатория

3.Устройство микроскопа

Техника безопасности

при работе в бактериологической лаборатории

1.В лабораторию входить только в халатах, шапочке (косынке), халат должен быть застегнут на все пуговицы, волосы спрятаны под шапочку.

2.В лабораторию нельзя вносить посторонние вещи, пищу.

3.Категорически запрещается в лаборатории курить, принимать пищу.

4.За каждым студентом закрепляется определенное место, микроскоп и дру-

гие принадлежности.

5. На рабочем месте размещают только необходимое оборудование для вы-

полнения конкретной работы.

6.Перед началом работы обязательно проверяют наличие и исправность приборов, посуды, газовых горелок. О неисправностях сообщают лаборанту.

7.Студенты без ведома преподавателя не должны включать аппаратуру.

8.Студенты приступают к работе только с разрешения преподавателя и вы-

полняют работу в соответствии с данной тематикой.

9. Необходимо соблюдать опрятность в работе, содержать в чистоте свое ра-

бочее место.

9

10. Материал, исследуемый на занятиях, должен рассматриваться как потен-

циально опасный.

11. Если в процессе работы культура микроорганизмов попала на стол необ-

ходимо удалить ее ватным тампоном, смоченным дезинфицирующим раствором и сообщить преподавателю.

12.Пробирки открывать у пламени горелки.

13.По окончании работы исследуемую культуру сдают преподавателю или помещают в банки с дезинфицирующими растворами, туда же помещают инстру-

менты, бывшие в контакте и культурой.

14. Перед уходом из лаборатории халат снимают, обрабатывают руку де-

зинфицирующим средством и тщательно моют.

Устройство бактериологической лаборатории

Бактериологическая лаборатория (отдел) входит в состав ветеринарной лабо-

ратории. В ней проводят бактериологическую диагностику болезней сельскохо-

зяйственных животных (включая птиц), пушных зверей, рыб и пчел, проведение экспертизы мяса, молока и других пищевых продуктов кормов.

Материалом для исследований служат кровь, мокрота, фекалии, моча, молоко от больных, кусочки паренхиматозных органов от павших и вынужденно убитых животных, а также пробы объектов внешней среды: воды, воздуха, кормов, почвы и др.; пробы пищевых продуктов.

Лабораторию размещают в отдельном здании, вдали от дорог. В лаборатории предусматривают приемное отделение, патологоанатомический, бактериологиче-

ский, серологический, биохимический, вирусологический отделы; термостатные,

автоклавные, моечная, бактериологическая кухня (средоварочная). На бак.кухне готовят питательные среды для культивирования микроорганизмов, хранят сте-

рильную посуду, хорошо упакованные химические вещества, реактивы.

Для работы в стерильных помещениях оборудуют боксы и предбоксники. От англ. box – коробка, ящик, изолированные застенные камеры, предназначенные для микробиологических исследований в асептических условиях. Бокс состоит из

10

предбоксника и собственно бокса. В предбокснике хранят комплекс спецодежды,

запас инструментов, лабораторной посуды, питательных сред, реактивов.

Стены, пол, потолок, рабочая поверхность стола в боксе должны быть покры-

ты материалом, который можно легко дезинфицировать. Перед началом работы полы протирают дезраствором, воздух обеззараживают бактерицидными лампами.

У входа в бокс и предбоксник кладут дезковрики.

Лабораторных животных содержат в виварии, там же находятся здоровые ба-

раны-доноры, их кровь используют для приготовления эритроцитов для РСК,

РНГА, для приготовления кровяных питательных сред.

Устройство микроскопа

Микроскоп - это оптический прибор, позволяющий рассмотреть мелкие дета-

ли строения исследуемого объекта, размеры которых лежат за пределами разре-

шающей способности глаза (разрешающая способность глаза составляет 80 мкм).

Наиболее распространены световые биологические микроскопы: БИОЛАМ,

МИКМЕД, МБР (микроскоп биологический рабочий), МБИ (микроскоп биологи-

ческий исследовательский) и МБС (микроскоп биологический стереоскопиче-

ский). Они дают увеличение в пределах от 56 до 1350 раз. Стереомикроскоп

(МБС) обеспечивает подлинно объемное восприятие микрообъекта и увеличивает от 3,5 до 88 раз.

В микроскопе выделяют две системы: оптическую и механическую (рисунок

1). К оптической системе относят объективы, окуляры и осветительное устройст-

во (конденсор с диафрагмой и светофильтром, зеркало или электроосветитель).

Объектив - одна из важнейших частей микроскопа, состоит из металлическо-

го цилиндра с вмонтированными в него линзами. Увеличение объектива обозна-

чено на нем цифрами. В учебных целях используют обычно объективы х8 и х40.

Качество объектива определяет его разрешающая способность.

11

1 - окуляр, 2 - тубус, 3 - тубусодержатель, 4 - винт грубой наводки, 5 - микрометренный винт,

6 - подставка, 7 - зеркало, 8 - конденсор, ирисовая диафрагма и светофильтр,

9 - предметный столик, 10 - револьверное устройство, 11 - объектив,

12 - корпус коллекторной линзы, 13 - патрон с лампой, 14 - источник электропитания

Рисунок 1 - Устройство световых микроскопов: А - МИКМЕД-1; Б - БИОЛАМ.

Окуляр устроен намного проще объектива. Он состоит из 2-3 линз, вмонтиро-

ванных в металлический цилиндр. Между линзами расположена постоянная диа-

фрагма, определяющая границы поля зрения. Нижняя линза фокусирует изобра-

жение объекта, построенное объективом в плоскости диафрагмы, а верхняя слу-

жит непосредственно для наблюдения. Увеличение окуляров обозначено на них цифрами: х7, х10, х15. Окуляр, подобно лупе, дает прямое, мнимое, увеличенное изображение наблюдаемого объекта, построенное объективом.

Для определения общего увеличения микроскопа следует умножить увеличе-

ние объектива на увеличение окуляра.

Осветительное устройство состоит из зеркала или электроосветителя, кон-

денсора с ирисовой диафрагмой и светофильтром, расположенных под предмет-

12

ным столиком. Они предназначены для освещения объекта пучком света. Зеркало-

служит для направления света через конденсор и отверстие предметного столика на объект. Оно имеет две поверхности: плоскую и вогнутую. В лабораториях с рассеянным светом используют вогнутое зеркало. Электроосветитель устанавли-

вается под конденсором в гнездо подставки. Конденсор состоит из 2-3 линз, встав-

ленных в металлический цилиндр. При подъеме или опускании его с помощью специального винта соответственно конденсируется или рассеивается свет, па-

дающий от зеркала на объект. Ирисовая диафрагма расположена между зеркалом и конденсором. Она служит для изменения диаметра светового потока, направ-

ляемого зеркалом через конденсор на объект, в соответствии с диаметром фрон-

тальной линзы объектива и состоит из тонких металлических пластинок. С помо-

щью рычажка их можно то соединить, полностью закрывая нижнюю линзу кон-

денсора, то развести, увеличивая поток света. Кольцо с матовым стеклом или све-

тофильтром уменьшает освещенность объекта. Оно расположено под диафрагмой и передвигается в горизонтальной плоскости.

Механическая система микроскопа состоит из подставки, коробки с микро-

метренным механизмом и микрометренным винтом, тубуса, тубусодержателя,

винта грубой наводки, кронштейна конденсора, винта перемещения конденсора,

револьвера, предметного столика.

Подставка - это основание микроскопа.

Микрометренный винт служит для незначительного перемещения тубусо-

держателя, а, следовательно, и объектива на расстояния, измеряемые микрометра-

ми. Полный оборот микрометренного винта передвигает тубусодержатель на 100

мкм, а поворот на одно деление опускает или поднимает тубусодержатель на 2

мкм. Во избежание порчи микрометренного механизма разрешается крутить мик-

рометренный винт в одну сторону не более чем на половину оборота.

Винт грубой наводки используют для значительного перемещения тубусо-

держателя, а, следовательно, и объектива с целью фокусировки объекта при малом увеличении.

13

Тубус - цилиндр, в который сверху вставляют окуляры, он подвижно соединен с головкой тубусодержателя.

Револьвер предназначен для быстрой смены объективов, которые ввинчива-

ются в его гнезда. Центрированное положение объектива обеспечивает защелка,

расположенная внутри револьвера.

Тубусодержатель несет тубус и револьвер.

Предметный столик предназначен для расположения на нем препарата. В се-

редине столика имеется круглое отверстие, в которое входит фронтальная линза конденсора. На столике имеются две пружинистые клеммы - зажимы, закрепляю-

щие препарат.

Объективы различают сухие и погруженные (водные и масляные), т.е. им-

мерсионные. При пользовании сухими объективами между фронтальной линзой объектива и препаратом имеется прослойка воздуха. Световые лучи, проходящие через стекло препарата, попадая в воздушную прослойку, преломляются, откло-

няются и только часть их проникает в объектив. Для них необходимо большое ко-

личество света. При использовании иммерсионного объектива на микроскопируе-

мые препарат наносят каплю масла, т.к. коэффициент преломления его равен ко-

эффициенту преломления стекла. В эту каплю жидкости помещают линзу объек-

тива, образуется оптически однородная среда, в которой лучи не рассеиваются, а

проходят через фронтальную линзу, хорошо освещая поля зрения (рисунок 2).

Рисунок 2 – Принцип работы сухого и погруженного объективов.

14

Правила работы с микроскопом

1.Работать с микроскопом следует сидя;

2.Микроскоп осмотреть, вытереть мягкой салфеткой от пыли объективы,

окуляр, зеркало;

3. Микроскоп установить перед собой, на 2-3 см от края стола. Во время ра-

боты его не сдвигать;

4. Открыть полностью диафрагму, поднять конденсор в крайнее верхнее по-

ложение;

5. Установить освещение в поле зрения микроскопа, используя зеркало. Гля-

дя одним глазом в окуляр и пользуясь зеркалом с вогнутой стороной, направить свет от окна в объектив, а затем максимально и равномерно осветить поле зре-

ния. Если микроскоп снабжен осветителем, то подсоединить микроскоп к источ-

нику питания, включить лампу и установить необходимую яркость горения;

6. Положить микропрепарат на предметный столик так, чтобы изучаемый объект находился под объективом. Глядя сбоку, опускать объектив при помощи макровинта до тех пор, пока он полностью не погрузится в каплю иммерсионно-

го масла;

7. Смотреть одним глазом в окуляр и вращать винт грубой наводки на себя,

плавно поднимая объектив до положения, при котором хорошо будет видно изо-

бражение объекта. Нельзя смотреть в окуляр и опускать объектив. Фронтальная линза может раздавить покровное стекло, и на ней появятся царапины;

8. После появления изображения подстроить резкость, пользуясь микровин-

том;

9. Передвигая препарат рукой, найти нужное место, расположить его в цен-

тре поля зрения микроскопа;

По окончании работы иммерсионный объектив поднять и протереть от масла,

с рабочего столика снять препарат и поместить в дезинфицирующий раствор или отдать преподавателю, протереть чистой салфеткой все части микроскопа, на-

крыть его полиэтиленовым пакетом и поставить в шкаф.

15

Контрольные вопросы:

1.Назначение и принцип устройства бактериологической лаборатории.

2.Назвать правила поведения в лаборатории.

3.Как работать с иммерсионной системой микроскопа.

4.Назвать устройство объектива.

Тема 1.2. Основные формы бактерий. Бактериологические краски. Приго-

товление препаратов. Простые и сложные методы окрашивания.

Цель занятия: изучить морфологию бактерий, ознакомиться с основными кислыми и нейтральными красителями; изучить приготовление бактериологиче-

ских препаратов; ознакомиться с простыми и сложными методами окрашивания;

отработать специальные методы окраски кислото-спирто-щелочеустойчивых мик-

роорганизмов.

Содержание:

1.Основные формы бактерий.

2.Бактериологические краски.

3.Приготовление бактериологических препаратов.

4.Простые и сложные методы окрашивания.

Формы бактерий

Микробы делят на 4 группы:

1. Шаровидные формы (кокки) – от греч. – зерно,

шарик, имеют вид шара, 1 мкм в диаметре. Подразделяют на следующие виды: Рисунок 3 - Микрококки.

 Микрококки (от лат. micros - маленький) рас-

положены беспорядочно. В диаметре не превышают 0,5

мкм (например, Micrococcusluteus) (рисунок 3);

 Стафилококки (греч. staphyle - гроздь) обра-

зуют беспорядочные скопления клеток, напоминающие

закономерности (например, Staphylococcusaureus) (ри-

сунок 4);

 Стрептококки (греч. streptos - цепочка) рас-

положены длинными цепочками (Streptococcusequi),

деление происходит в одной плоскости и образующие-

ся клетки не разъединяются (рисунок 5);

 Диплококки (греч. diploos - двойной) распо- Рисунок 5 - Стрептококки.

ложены по две клетки (Streptococcuspneumoniae), делятся

водной плоскости (рисунок 6);

Тетракокки (от греч. tetra - четыре) располага-

ются по четыре, деление происходит в двух взаимно пер-

пендикулярных плоскостях (например, Рисунок 6 - Диплококки.

Aerococcusviridans) (рисунок 7);

 Сарцины (от греч. sarceo – соединяю) кокки, груп-

пирующиеся по 8 клеток, располагаются в виде пакетов,

куба, с каждой стороны которого по 4 клетки; получа- Рисунок 7 - Тетракокки.

ются в результате деления клетки в 3-х взаимно перпенди-

кулярных плоскостях (Sarcinaureae) (рисунок 8).

Бактериологические краски

В микробиологической практике для окрашивания мазков используют ани-

линовые краски. Различают основные и кислые красители.

У основных красителей ионом, придающим бактериальной клетке окраску,

служит катион, у кислых - анион. Клеточные структуры бактерий, взаимодейст-

вующие с красителем, заряжены преимущественно отрицательно и поэтому лучше воспринимают основные красители, к которым относятся:

-фиолетовые (генцианвиолет; кристаллический фиолетовый);

-красные (основной фуксин, сафранин);

-синие (метиленовая синь);

-зелёные (малахитовый зеленый).

Все краски представляют собой аморфные порошки или кристаллы.

Анилиновые краски плохо растворяются в воде, поэтому вначале готовят на-

сыщенные спиртовые растворы красок (1:10), из которых затем получают рабочие водные растворы.

В бактериологической практике чаще применяют следующие краски:

- щелочная метиленовая синь (синька Леффлера) - применяется для простого метода окрашивания, она всегда должна находиться на столе у бактериолога;

-карболовый основной фуксин Циля- концентрированная краска, хранится долгое время; применяется при окрашивании трудно прокрашивающихся бакте-

рий, таких как возбудитель туберкулеза, споры бактерий;

-разведенный фуксин (фуксин Пфейффера) –это фуксин Циля, разведенный дистиллированной водой 1:10; применяется для простого метода окрашивания или как один из компонентов окраски по Граму, краску готовят перед применением и используют в течение одного рабочего дня;

-карболовый генцианвиолет используют как основной краситель при окраске по Граму, в модификации по Синеву чаще применяют в виде кусочков фильтро-

вальной бумаги, пропитанных краской и высушенных;

- раствор малахитовой зелени (1 % водный), применяемый при окраске бру-

целл по Козловскому, при окраске спор.

19