26. Методы определения ферментативной активности микроорганизмов.

Определение ферментативной активности микроорганизмов важно для характеристики их метаболизма, диагностики, а также для биотехнологических и медицинских целей. Существует несколько основных методов для оценки активности ферментов, которые можно разделить на прямые и косвенные.

1. Качественные методы (скрининговые)

- Проба на агаровых средах с субстратами:

- В среду добавляют специфический субстрат (например, крахмал, желатин, казеин).

- После роста культуры наблюдают зоны гидролиза (прозрачные зоны вокруг колоний), указывающие на активность соответствующего фермента.

- Примеры:

- Проба на амилазу: агар с крахмалом, после инкубации добавляют йод; зона обесцвечивания вокруг колоний говорит о гидролизе крахмала.

- Проба на протеазы: агар с казеином или желатином; появление прозрачных зон указывает на протеолитическую активность.

- Проба на липазу: агар с триглицеридами; образование прозрачных или жирорастворимых зон.

- Цветные индикаторы:

- Использование реактивов, меняющих цвет при взаимодействии с продуктами ферментативной реакции.

- Пример: использование бромтимолового синего для выявления продукции кислот или щелочей.

2. Количественные методы

- Спектрофотометрические методы:

- Измерение изменения оптической плотности раствора, связанного с образованием или разрушением субстрата/продукта.

- Пример: определение активности лактазы по гидролизу ONPG (ортонитрофенил-β-галактозида) с образованием желтого продукта, измеряемого при 420 нм.

- Хроматографические методы:

- Анализ продуктов ферментативной реакции с помощью ВЭЖХ, ГХ и др.

- Позволяют точно измерить количество продуктов или субстратов.

- Электрохимические методы:

- Измерение изменения концентрации субстратов или продуктов с помощью электродов (например, для определения активности оксидаз).

- Флуориметрические методы:

- Измерение флуоресценции продуктов реакции с использованием специальных субстратов.

Биохимические тесты и наборы

- Использование наборов для определения ферментативной активности:

- Коммерческие тест-системы (например, API, Enterotube и др.) содержат субстраты и индикаторы для выявления активности различных ферментов.

- Результаты интерпретируются по изменению цвета или других признаков.

4. Биофизические методы

- Электрофорез ферментов:

- Разделение ферментов по электрофоретической подвижности и определение активности на геле.

- Измерение выделения газов:

- Например, определение активности ферментов, приводящих к выделению CO₂ или H₂.

27. Культивирование аэробов. Техника посева и пересева микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.

Посев на твердых питательных средах

Некоторые методы посева анаэробов на твёрдые питательные среды:

Метод штриха. Часть культуры берут на бактериологическую петлю и наносят лёгкую штриховую линию по поверхности агара. Так посевают культуры на чашки Петри или скошенный агар в пробирке.

Метод укола вглубь среды. Проводится с помощью бактериологической петли или иглы определённой длины. Посев осуществляют в пробирки, наполненные плотной питательной средой на 2/3, и делают укол вглубь среды на величину длины петли (иглы).

Метод распределения по поверхности агара шпателем Дригальского. Используется для посевов из жидкостей или жидкой питательной среды на чашки Петри. Определённое количество жидкости наносят в центр чашки Петри стерильной пипеткой и распределяют по поверхности с помощью стерильного шпателя Дригальского.

Посев в жидких питательных средах

Для посева анаэробов в жидких питательных средах применяют, например, следующий метод:

Посев с помощью бактериологической петли. Петлю стерилизуют, опускают в пробирку с культурой, захватывают небольшое количество микробной биомассы.

Посев пипеткой. Стерильной пипеткой набирают заданный объём жидкой культуры и вносят в питательную среду. Для равномерного распространения материала пробирку осторожно стряхивают или вращают, зажав в ладонях.

Пересев культур

При пересеве культур анаэробов важно соблюдать стерильность и избегать резких движений, которые могут вызвать движение воздуха. Некоторые методы пересева:

Метод реплик. Используют стерильные кусочки бархата с коротким, жёстким и густым ворсом. Чашки Петри с питательной средой и сформировавшимися колониями микроорганизмов накладывают поверхностью среды на бархат и слегка прижимают. Чашку осторожно снимают, а бархат с отпечатками колоний используют для засева других чашек со средой.

Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 0,9% изотоническим раствором, перемешивают и переносят в пробирку с охлаждённым до 45–50°С сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания содержимое пробирки засевают ещё в две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают под струёй воды. Выросшие в глубине питательной среды колонии пересевают для выделения чистой культуры.