20. Краски и красящие растворы, применяемые в бактериологической практике. Техника приготовления окрашенного бактериального препарата.

Бактериологические красители. Для окрашивания бактериаль­ных клеток применяют синтетические анилиновые красители, которые дифференцируют на основные и кислые. У основных красителей ионом, придающим бактериальной клетке окраску, служит катион, у кислых — анион. Структуры бактерий, взаимо­действующие с красителем, преимущественно отрицательно за­ряжены и поэтому лучше воспринимают основные красители.

• Основные красители. Красные (нейтральный красный, пиро-нин, сафранин, основной фуксин); фиолетовые (генциан фиоле­товый, кристаллический фиолетовый, гематоксилин, тионин); синие (виктория, метиленовый синий); зеленые (малахитовый зеленый, метиленовый зеленый, янус зеленый); коричневые (везувин, хризоидин); черные (индулин).

• Кислые красители. Розовые и красные (кислый фуксин, эозин, эритрозин, гропеолин); желтые (аурантил, конго, пикриновая кислота); черные (нигрозин).

• Спиртовые растворы. Эти растворы длительного хранения го­товят из сухих порошковых красок. Растворы сначала выдержи­вают в термостате для лучшего растворения веществ, затем филь­труют через бумажные фильтры, чтобы избавиться от нераство­рившихся микрочастиц, которые при окраске препаратов оседа­ют на клетках, тем самым затрудняя их изучение под микроско­пом.

• Водные растворы. Так как эти растворы красителей нестойкие, их готовят непосредственно перед использованием

Приготовление бактериальных препаратов для световой микроскопии. Приготовление окрашенных бактериальных препаратов включает в себя приготовление мазка, его высушивание, фиксацию и окрашивание.

1. Подготовка предметного стекла. На стерильное стекло наносят каплю воды, в которую затем бактериологической петлёй вносят и распределяют по поверхности лабораторный материал.

2. Высушивание. Лишнюю жидкость высушивают естественным путём при комнатной температуре или прогревают мазок высоко над пламенем горелки.

3. Фиксация. Бактерии закрепляют на предметном стекле, для этого используют огонь (несколько проходов над самой горячей частью пламени) или жидкость (спирт, ацетон). После такой обработки микроорганизмы быстрее впитывают краску.

4. Окрашивание. Краска должна полностью покрывать всю поверхность мазка. Выдержав нужное время (для каждого красителя своё), краску убирают и промывают препарат водой.

21. Строение светового микроскопа, техника микроскопии фиксированного бактериального препарата.

Световой микроскоп состоит из механической и оптической частей. Каждая из них включает отдельные элементы, которые выполняют определённые функции.

Механическая часть

К механической части светового микроскопа относятся:

• Штатив с основанием, на котором крепится прибор. 

• Предметный столик с двумя клеммами для фиксации препарата. 

• Тубус — трубка, в которую сверху вставляют окуляр. 

• Револьвер для крепления и смены объективов. 

• Винты грубой и точной настройки (макро- и микровинты) для перемещения тубуса и предметного столика.

Оптическая часть

Оптическая часть светового микроскопа включает:

• Объектив — систему линз, которая фокусирует свет от объекта. 

• Окуляр — систему линз, через которую наблюдатель смотрит на изображение. 

• Осветительное устройство — обычно состоит из подвижного зеркала и конденсора с диафрагмой. 

Диафрагма служит для изменения ширины светового потока и равномерного освещения поля зрения. Зеркало имеет две поверхности: плоскую и вогнутую. Вогнутую поверхность используют при слабых источниках освещения, плоскую — при ярком свете. 

Техника микроскопии фиксированного бактериального препарата:

Микроскопия

1. Подготовка микроскопа. На препарат наносят небольшую каплю иммерсионного масла.

2. Настройка освещения. Конденсор поднимают вверх до упора, ирисовую диафрагму конденсора открывают полностью.

3. Опускание тубуса. Макрометрическим винтом опускают тубус до погружения объектива в масло, почти до соприкосновения линзы с предметным стеклом препарата. Это нужно проводить осторожно, чтобы фронтальная линза не сместилась.

4. Просмотр в окуляр. Смотрят в окуляр, медленно вращают макрометрический винт на себя и, не отрывая объектив от масла, приподнимают тубус до появления контуров объекта.

5. Точная фокусировка. Используют макрометрический винт.

6. Рассмотрение нескольких полей зрения. Передвигают столик боковыми винтами.

После микроскопии тубус микроскопа поднимают, снимают препарат и переводят микроскоп в нерабочее положение: фронтальную линзу объектива протирают мягкой фланелевой салфеткой, объектив выключают из хода световых лучей поворотом револьвера. Иммерсионное масло, остающееся на стекле препарата, удаляют небольшим кусочком ваты.