8. Лабораторная диагностика

Диагностика дифтерии. Лабораторную диагностику дифтерии проводят согласно МУК 4.2.3065-13. Бактериоскопическое исследование при дифтерии проводится редко, так как эффективность этого метода очень низкая в связи с возможностью обнаружения в мазках коринебактерий – представителей нормальной микробиоты. Например, в носоглотке часто обнаруживается C. pseudodiphtheriticum (палочка Хофмана), а на слизистой оболочке глаз - C. xerosis.

Бактериологическое (культуральное) исследование предусматривает выделение чистой культуры на элективных питательных средах и изучение ее биохимических свойств. Особое внимание уделяется пробе Пизу на цистиназу, пробе Закса на уреазу, изучению ферментативной активности с использованием укороченного пестрого ряда (глюкоза, сахароза, крахмал). В обязательном порядке. проводится определение токсигенности выделенных чистых культур. Серологические методы диагностики являются ретроспективными.

Бактериологическое исследование проводят в следующих случаях:

- диагностическое обследование детей и взрослых с острыми воспалительными явлениями в области зева, носа и носоглотки, особенно при подозрении на дифтерию;

- обследование по эпидемическим показаниям детей и взрослых, бывших в контакте с источником инфекции;

- выявление возможных бактерионосителей среди лиц, вновь поступающих в детские дома, школы-интернаты.

Исследуемый материал. В качестве исследуемого материала используют слизь и пленки из очагов воспаления. Сбор материала необходимо проводить в течение 3-4 часов (не позже 12 часов) с момента обращения больного. Для взятия материала используют сухие ватные тампоны (если посев будет проведен не позднее 2-3 часов после сбора материала) или тампоны, предварительно смоченные 5% раствором глицерина (при транспортировке материала на дальние расстояния). Материал для исследования берут отдельными тампонами из ротоглотки (с миндалин) и из носа (рисунок 8.33). Отбор материала следует проводить не ранее чем через 2 часа после еды. При дифтерии редких локализаций (глаз, ухо, кожная рана) материал берут с пораженных участков, а также с миндалин и из носа. При наличии налетов материал берут с границы пораженных и здоровых тканей. Посев материала необходимо провести не позднее чем через 3 часа после его взятия.

Схема микробиологического исследования при дифтерии:

1 день:

- бактериоскопическое исследование (окраска мазков корифосфином, по Граму и Нейссеру);

- посев исследуемого материала на одну из рекомендованных плотных питательных сред.

2 день:

- определение характера роста культур, микроскопия мазков, приготовленных с посевов и окрашенных по Граму и Нейссеру; - посев из отдельных колоний на среду для определения токсигенности (посев из половины колонии);

- посев на скошенный сывороточный агар для получения чистой культуры (посев из другой половины колонии).

3 день:

- посев чистой культуры на укороченный пестрый ряд (глюкоза, сахароза, крахмал);

- посев чистой культуры для выявления гемолиза, цистиназы (проба Пизу) и уреазы (проба Закса);

- постановка реакции агглютинации.

4 день:

- учет результатов;

- выдача заключения о выделении токсигенных или нетоксигенных коринебактерий.

Окончательный ответ о наличии токсигенных бактерий выдается через 48-72 часа. Окончательный ответ по биохимическим свойствам нетоксигенных бактерий выдается через 72-96 часов.

Для определения токсигенности выделенной культуры (реакция преципитации в геле, тест иммунодиффузии Илека или Элека) полоску фильтровальной бумаги смачивают антитоксической противодифтерийной сывороткой и помещают на поверхность питательной среды в чашке Петри. Испытуемые культуры высевают бляшками или штрихами по обе стороны от полоски. На одну чашку высевают несколько штаммов, один из которых является заведомо токсигенным (из коллекции лаборатории) и служит контролем. Чашки с посевами инкубируют при 37ОС, результаты учитывают через 24-48 часов. В результате встречной диффузии антитоксина и токсина на месте их взаимодействия образуется четкая полоса преципитации в виде полукруглой линии или “усов”. В настоящее время для выявления токсигенных дифтерийных бактерий используют следующие методы:

- иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием меченых пероксидазой или щелочной фосфатазой антитоксических антител;

тест с иммунохроматографическими полосками (ICS), на которые нанесены антитоксические антитела, меченые коллоидным золотом;

- полимеразная цепная реакция (ПЦР) для непосредственного обнаружения tox-оперона.

Ускоренными методами выявления коринебактерий являются:

- микроскопический метод;

- иммунофлюоресцентный метод;

- метод “свернутого тампона” (метод Фольгера или Фольгера-Золле) - метод забора материала для бактериологического исследования на дифтерийную палочку с помощью стерильного ватного тампона, пропитанного лошадиной сывороткой. Сыворотку крови свертывают, а тампоны после взятия материала помещают на 4–6 часов в термостат, после чего используют для приготовления мазка.

Однако эти методы не позволяют говорить о токсигенности выделенных культур.

Серологические методы при дифтерии являются методами ретроспективной диагностики, поэтому они имеют вспомогательное значение.

РНГА (РПГА) с антигенным эритроцитарным диагностикумом используется для оценки напряженности антитоксического иммунитета. Эритроцитарный диагностикум получают сенсибилизацией эритроцитов дифтерийным анатоксином. Защитный титр антител в РНГА равен 1:40. Если антитела обнаруживаются в более низких разведениях сыворотки, требуется ревакцинация. Учет результатов осуществляют визуально - по степени агглютинации эритроцитов. Положительными считаются пробы, давшие реакцию агглютинации не менее чем на два плюса (++).

Для оценки напряженности антитоксического иммунитета ранее широко применялась проба Шика: в кожу средней трети ладонной поверхности предплечья вводят 1/40 Dlm дифтерийного токсина в объеме 0,2 мл. При отсутствии в крови антитоксинов на месте введения токсина через 24-48 часов появляются припухлость и покраснение. При наличии антитоксинов (1/30 АЕ/мл) местных проявлений не наблюдается. В настоящее время эта проба практически не используется.