1 . Определить коэффициент фосфорилирования и число образовавшихся атф, если в эксперименте с изолированными митохондриями в качестве окисляемого субстрата использовали:

1) Малат; 2) а- кетоглутарат; 3) изоцитрат.

Как изменится коэффициент Р/О в каждом случае, если:

• в инкубационную смесь добавить ингибитор НАД-зависимых дегидрогеназ;

• вместе с ингибитором добавить сукцинат;

• вместе с ингибитором добавить аскорбиновую кислоту, которая может окисляться цитохромом С;

• добавить ингибитор цитохромоксидазы;

• добавить разобщители окисления и фосфорилирования.

Ответ:

Коэффициент фосфорилирования - сколько молекул АТФ образуется при потреблении одного атома кислорода.

1. Малат :В цикле Кребса окисляется с образованием НАДН Н+, при окислении 1 молекулы НАДН Н+ образуется 3 молекулы АТФ (Р/О=3), но можно сказать, что 2,5, т.к. часть энергии, высвобождающейся при транспорте электронов, расходуется не на синтез АТФ, а для переноса веществ через митохондриальную мембрану. α- кетоглутарат: изначально окисляется до Сукцинил-КоА с образованием одной молекулы НАДН+, после чего Сукцинил превращается в сукцинат с образованием ГТФ (аналогичен АТФ), сукцинат в фумарат с образованием ФАДН2, после в малат и малат в оксалоацетат с образованием ещё одной молекулы НАДН+. При окислении 1 молекулы НАДН Н+ образуется 3 молекулы АТФ => образовалось 6 молекул АТФ. При окислении 1 молекулы ФАДН2 образуется 2 молекулы АТФ, а ГТФ аналогичен АТФ. Получается, что образуется 9 молекул АТФ. ГТФ не «расходует» кислород. Р/О= (2*3)+(1*2)/3 = 2,33. Изоцитрат: при окислении изоцитрата до ацетил-коэнзим А образуется 3 НАДН+, ГТФ, ФАДН2 => 9 АТФ + 1 ГТФ + 2 АТФ = 12 АТФ. Р/О = 3 по НАДН (или (3*3)+(1*2)/4=9,5, я хз)

2. В инкубационную смесь добавить ингибитор НАД-зависимых дегидрогеназ. Ингибитор НАД-зависимых дегидрогеназ подавляет ферменты, которые образуют НАДН, — например, малатдегидрогеназу, изоцитратдегидрогеназу, альфа-кетоглутаратдегидрогеназу. Из-за этого уменьшается или полностью прекращается образование НАДН. Электроны в дыхательной цепи поступают в основном через ФАДН₂ (комплекс II) или не поступают вовсе. Малат: в норме окисляется с образованием НАДН → Р/О = 3. При ингибировании НАД-зависимых дегидрогеназ: образование НАДН блокируется, малат не может эффективно окисляться, так как не образуется восстановленный кофермент для дыхательной цепи. Поток электронов через дыхательную цепь практически прекращается, Р/О сильно снижается, приближаясь к 0 (АТФ практически не образуется). α-Кетоглутарат: в норме при его окислении образуются 2 НАДН и 1 ФАДН₂ → Р/О ≈ 2,33. При ингибировании НАД-зависимых дегидрогеназ: образование 2 НАДН блокируется, остаётся только через ФАДН₂. Р/О снижается с ~2,3 до примерно 2 — коэффициента фосфорилирования, характерного для ФАДН₂. Изоцитрат: в норме окисляется с образованием НАДН → Р/О = 3. При ингибировании НАД-зависимых дегидрогеназ: образование НАДН блокируется, изоцитрат не может быть эффективно окислен и не передаёт электроны в дыхательную цепь. Р/О резко снижается, приближаясь к 0, потому что изоцитрат не окисляется другими путями.

3. Вместе с ингибитором добавить сукцинат. Сукцинат — субстрат сукцинатдегидрогеназы, напрямую отдаёт электроны в цепь, минуя комплекс I. Малат: сам по себе не может эффективно окисляться без НАД-зависимых дегидрогеназ, но добавление сукцината обеспечивает поступление электронов через комплекс II (ФАДН2). Электроны проходят через комплекс II → III → IV, формируя протонный градиент и синтезируя АТФ. Р/О определяется исключительно путём от сукцината — 2. В этом случае малат не участвует в Р/О, но дыхательная цепь продолжает работать за счёт сукцината. α-Кетоглутарат: ингибитор блокирует образование НАДН из α-кетоглутарата, но сукцинат обеспечивает поток электронов через комплекс II (ФАДН2). Ранее α-кетоглутарат обеспечивал Р/О 2,33 за счёт НАДН и ФАДН2, теперь остаётся только ФАДН2. Р/О снижается с 2,33 до примерно 2 за счёт электротока от сукцината. Электроны идут только через комплекс II. Изоцитрат: как и в случае с малатом, изоцитрат не может образовывать НАДН при блокировке дегидрогеназ, но наличие сукцината обеспечивает электроны через комплекс II. Р/О возрастает примерно от 0 (при блокаде без сукцината) до примерно 2 (за счёт сукцината).

4. Вместе с ингибитором добавить аскорбиновую кислоту, которая может окисляться цитохромом С; Аскорбиновая кислота может восстанавливать цитохром c напрямую, минуя комплексы I и II. Электроны от цитохрома c поступают к комплексу IV, где происходит восстановление кислорода до воды. Что происходит при добавлении аскорбиновой кислоты и ингибитора? НАД-зависимые дегидрогеназы заблокированы → поток электронов через комплекс I отсутствует. Электроны от аскорбиновой кислоты попадают напрямую на цитохром С (между комплексами III и IV). Этот путь обходит протонные насосы комплексов I и II, а комплекс III при этом не задействован (поскольку электроны подаются ниже по цепи). Комплекс IV всё ещё окисляет кислород, но количество протонов, перекачиваемых через мембрану, значительно сокращается. Следовательно, протонный градиент, приводящий к синтезу АТФ, сильно падает, и Р/О резко уменьшается, очень низкий (практически 0), поскольку электроны не создают градиент

5. Добавить ингибитор цитохромоксидазы. Цитохромоксидаза (комплекс IV) — последний комплекс дыхательной цепи, где происходит перенос электронов на кислород с образованием воды. Ингибитор цитохромоксидазы (например, цианид, азид) блокирует этот комплекс, останавливая конечный перенос электронов. В результате электроны не могут пройти через цепь, перекачка протонов останавливается, и синтез АТФ прекращается. Произойдёт остановка дыхательной цепи целиком. Все субстраты выводятся из цикла, поскольку их окисление зависит от функционирования всей цепи переноса электронов. Накопление восстановленных коферментов. НАДН и ФАДН₂ не окисляются, митохондрии не потребляют кислород. Прекращение протонного градиента. Без переноса электронов через комплекс IV не происходит перекачки протонов, не генерируется протонный мотив. Синтез АТФ резко снижается или прекращается. Коэффициент Р/О становится близким к нулю.

6. Добавить разобщители окисления и фософрилирования. Разобщители (2,4-динитрофенол (ДНФ), хлорамицетат и другие жирные кислоты) разрушают протонный градиент через внутреннюю мембрану митохондрий. Они «протекают» через мембрану, позволяя протонам возвращаться в матрикс без прохождения через АТФ-синтазу. В результате электроны продолжают течь по дыхательной цепи, кислород потребляется, но энергия расходуется на «протекание» протонов, а не на синтез АТФ. Коэффициент Р/О показывает, сколько молекул АТФ образуется на каждый атом кислорода, потребленный при окислении. При добавлении разобщителей, электроны проходят через дыхательную цепь и кислород потребляется, но синтез АТФ уменьшается, так как часть энергии теряется. Р/О резко падает, приближаясь к нулю, даже несмотря на активное потребление кислорода.

2. Выберите соединения, которые участвуют в переносе электронов от изоцитрата на кислород, и разместите их так, как они располагаются в дыхательной цепи: 1.НАД+ 2.ФАД+ 3.Цитохром С 4.Цитохром аа3 5. Убихинон 6.Кислород 7. ΦΜΗ 8.Н+- АТФаза 9. Цитохром б 10. Цитохром с1

Ответ: Итоговый упорядоченный ряд (для переноса электронов от изоцитрата на кислород):

1. НАД⁺ (в цикле Кребса → НАДН)

2. НАДН передаёт электроны своему комплексу (I), в списке нет комплекса, но ФМН можно считать частью комплекса I

3. Убихинон (кофермент Q)

4. Цитохром С

5. Цитохром ааз (комплекс IV)

6. Кислород

7. Н⁺-АТФаза (АТФ-синтаза) — использует протонный градиент, образуемый работой дыхательной цепи

1 7 5 9 3 4 6

3. Выберите соединения, участвующие в переносе электронов от янтарной кислоты на кислород и разместите их так, как они располагаются в дыхательной цепи: 1. Цитохромоксидаза 2. CoQ 3. НАД-дегидрогеназа 4. НАД+ 5. Цитохром С 6. Кислород 7. Малатдегидрогеназа 8. НАДФ+ 9. Сукцинатдегидрогеназа 10. QH2-дегидрогеназа

Ответ: Участвующие соединения:

1. Сукцинатдегидрогеназа (№9) — фермент, окисляющий янтарную кислоту и передающий электроны на ФАД (ФАДН2).

2. CoQ (Убихинон) (№2) — переносчик электронов от комплекса II к комплексу III.

3. Цитохром c (№5) — переносчик электронов от комплекса III к комплексу IV.

4. Цитохромоксидаза (комплекс IV) (№1) — принимает электроны от цитохром c и передаёт их кислороду.

5. Кислород (№6) — конечный акцептор электронов.

Что НЕ участвует или не относится к цепи при окислении янтарной кислоты:

• НАД-дегидрогеназа (комплекс I) (№3) — переносит электроны от НАДН, не участвует при окислении янтарной кислоты.

• НАД⁺ (№4), НАДФ⁺ (№8) — коферменты, связанные с другими реакциями.

• Малатдегидрогеназа (№7) — фермент, не участвующий при прямом переносе электронов от янтарной кислоты.

• QH2-дегидрогеназа (№10) — другое название для комплекса III, но в списке уже есть цитохром c и цитохромоксидаза для дальнейших шагов.

Правильный порядок переноса электронов от янтарной кислоты на кислород:

1. Сукцинатдегидрогеназа (9) — окисляет янтарную кислоту, передаёт электроны на ФАД → ФАДН2.

2. CoQ (убихинон) (2) — переносит электроны от комплекса II (сукцинатдегидрогеназы) к комплексу III.

3. Цитохром c (5) — переносит электроны от комплекса III к комплексу IV.

4. Цитохромоксидаза (комплекс IV) (1) — передаёт электроны кислороду.

5. Кислород (6) — конечный акцептор электронов.

9 2 5 1 6

4. Подберите к перечисленным регуляторным ферментам соответствующие модуляторы (эффекторы) - активаторы или ингибиторы:

1. Пируватдегидрогеназный комплекс. 2. Цитратсинтаза. 3. Изоцитратдегидрогеназа. 4. а-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс

А. Цитрат. Б. Ацетил-СоА. С. АТФ. Д. Сукцинил~СоА

1. Ответ: Пируватдегидрогеназный комплекс — Б. Ацетил-СоА — активатор этого комплекса.  16

2. Цитратсинтаза — Д. Сукцинил-СоА — ингибитор цитратсинтазы, так как понижает её сродство к ацетил-СоА.  2

3. Изоцитратдегидрогеназа — А. АДФ и Ca2+ — активаторы изоцитратдегидрогеназы.  16

4. Альфа-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс — Д. Сукцинил-СоА — ингибитор активности этого комплекса.

5. В суспензию митохондрий добавили 2 ммоль цитрата и 2 ммоль АДФ. Измерили скорость окисления по поглощению кислорода. Через некоторое время реакция прекратилась:

• объяснить почему, и как ее запустить;

• сколько молей субстрата осталось неокисленными?

Ответ:

• Почему остановилась реакция? В митохондриях синтез АТФ зависит от наличия субъстрата (цитрата), кислорода и АДФ. АДФ — ключевой лимитирующий фактор для окислительного фосфорилирования: синтез АТФ происходит из АДФ+Pi. Когда весь АДФ в системе превращается в АТФ, дальнейший синтез АТФ останавливается. При отсутствии свободного АДФ АТФ-синтаза не работает, не расходует протонный градиент. Протонный градиент накапливается, блокируя перенос электронов и окисление субстрата останавливается, несмотря на избыток кислорода и цитрата.

• Как запустить реакцию снова? Добавить новую порцию АДФ в суспензию. Это позволит АТФ-синтазе снова синтезировать АТФ, расходовать протонный градиент. Восстановится перенос электронов и окисление цитрата возобновится.

• Сколько молей субстрата осталось неокисленными? Все молекулы АДФ (2 ммоль) могут быть конвертированы в 2 ммоль АТФ. Чтобы окислить 1 молекулу цитрата полностью, нужно синтезировать ~12 молекул АТФ. Следовательно, 2 ммоль АДФ позволят синтезировать 2 ммоль АТФ, что соответствует окислению лишь части цитрата. Окисленное количество цитрата = 2 ммоль АДФ/12=0,166 ммоль. Окисленное количество цитрата = 12 ммоль АДФ=0,166 ммоль. Следовательно, из 2 ммоль цитрата окислено примерно 0,16,6 ммоль. Остаток неокисленного цитрата: 2−0,166=1,84 ммоль