ЯГТУ / Профессиональная подготовка специалистов для производства иммунобиологических лекарственных препаратов (вакцин). Направление «Biotechnical» / Лекция №1. Эукариотические клеточные культуры и методы работы с ними (презентация)
.pdf
БОКС МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ |
21 |
–Главное рабочее место в лаборатории клеточных культур, где осуществляется асептическая работа с культурами клеток, представлено боксом микробиологической* безопасности (англ. – microbiological safety cabinet, MSC).
*Бокс биологической безопасности – согласно европейскому стандарту EN 12469:2000
–Бокс микробиологической безопасности** – это вентилируемое ограниченное пространство, предназначенное для обеспечения защиты оператора и окружающей среды от аэрозолей, возникающих вследствие работы с потенциально опасными и опасными микроорганизмами, с помощью удаления воздуха в атмосферу путем фильтрации.
** Согласно ГОСТ Р ЕН 12469-2010 Биотехнология. Технические требования к боксам микробиологической безопасности
–Боксы микробиологической безопасности в зависимости от уровня обеспечиваемой защиты классифицируются на I, II и III класс.
Схема воздушных потоков в MSC II, |
|
где красный – это контаминированный, |
Бокс микробиологической |
синий – очищенный, а зеленый – наружный воздух. |
безопасности класс II (LAMSYSTEMS) |
ИНВЕРТИРОВАННЫЙ МИКРОСКОП |
22 |
–
порт для камеры
–
конденсор
тринокулярная головка
Инвертированный микроскоп (англ. – inverted microscope) – микроскоп, с помощью которого можно микроскопировать клетки прямо в культуральной ёмкости без приготовления цитологических препаратов, что позволяет легко и быстро получить сведения о морфологии культивируемых клеток, фазе роста культуры и степени конфлюентности монослоя.
С помощью инвертированного микроскопа легко распознаются черты микробиологической контаминации.
дисплей
Инвертированный микроскоп Olympus СКХ41 оборудован |
|
фазово-контрастной оптикой, тринокулярной головкой |
|
и портом для присоединения цифровой фотокамеры. |
EVOS imaging systems |
ДОЗИРУЮЩИЕ УСТРОЙСТВА И МАТЕРИАЛЫ |
23 |
Автоматический дозатор для серологических пипеток
Стерильные серологические пипетки в индивидуальной упаковке
Серологические пипетки в ассортименте: |
Механические одноканальные и многоканальные дозаторы |
1 мл, 2 мл, 5 мл, 10 мл, 25 мл и 50 мл |
регулируемого объема от 0,1 мкл до 10 мл с наконечниками |
ОБЩЕЛАБОРАТОРНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ |
24 |
Наиболее часто используемое в работе с клетками общелабораторное оборудование
Вид оборудования |
Область применения |
Центрифуги – Концентрирование клеток, отмывка клеток
–для микро- и центрифужных пробирок, многолуночных планшетов; с/без охлаждением
Водяная баня с |
– |
Подогрев питательной среды и других |
||||||
регулируемой |
|
культуральных |
добавок, |
оттаивание |
||||
температурой нагрева |
|
криозамороженной клеточной линии |
|
|
||||
Холодильники (4-8 |
) |
– |
Хранение |
питательных |
сред |
и |
других |
|
|
|
|
культуральных добавок |
|
|
|
||
Морозильники (-20 |
) |
– |
Продолжительное хранение сыворотки, растворов |
|||||
|
|
|
трипсина и других культуральных добавок |
|
||||
Низкотемпературные |
– |
Хранение некоторых клеточных продуктов, |
||||||
морозильники (-70 90 |
) |
|
замораживание культур клеток |
|
|
|||
Сосуды Дьюара с жидким |
– |
Криозамораживание культур клеток |
|
|
||||
азотом (-196 |
) |
|
|
|
|
|
|
|
Прямой световой |
– |
Цитологические исследования, подсчет клеток в |
||||||
микроскоп |
|
гемоцитометре (камере Горяева) |
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
… а также лабораторные весы, вортексы, шейкеры и т.д. …
Центрифуга для культуральных планшетов
Сосуды Дьюара
ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ПОДСЧЕТА КЛЕТОК |
25 |
– Подсчет клеток можно осуществлять двумя способами:
1)вручную с помощью гемоцитометра (камеры Горяева) и светового микроскопа;
2)на автоматическом счетчике клеток (англ. – cell counter).
Порядок работы:
Х =
А × 250000 × Р 20
нанести образец в |
вставить слайд в |
оценить результаты |
ячейку слайда |
счетчик |
на дисплее |
– Автоматический счетчик клеток позволяет быстро и просто получать точные результаты в ограниченном диапазоне концентрации клеток.
|
Автоматический счетчик клеток TC20 (Bio-Rad) с |
Световой микроскоп с гемоцитометром |
одноразовыми слайдами |
ТЕХНИКА АСЕПТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ |
26 |
–Техника асептической работы (англ. – Good Aseptic Technique) имеет целью исключить заражение путем установления жестких норм, правил и гарантий того, что каждый сотрудник, использующий оборудование, придерживается их.
–Базовые правила асептики:
1) Поверхность рабочего места должна быть ровной и чистой, на ней должны находиться лишь те предметы, которые вам необходимы для работы в настоящее время.
2) Приготовьте заранее то, что вам может понадобиться, так чтобы культуры вынимались из инкубатора на менее продолжительный срок, все манипуляции должны производиться так быстро, как это возможно, без препятствий и помех.
3) Предметы на столе должны располагаться в зоне прямой видимости.
4) Избегайте случайного контакта стерильных и нестерильных поверхностей.
5) После работы оставляйте рабочее место
чистым.
ЗОНИРОВАНИЕ ЛАБОРАТОРИИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР |
27 |
–вместимость: 2-3 сотрудника;
–возможно увеличение вместимости до 5-6 человек за счёт переноса моечной,
стерилизационной и препаративной зон в другие помещения.
зона |
инкубирования |
хранение |
Устройство простой лаборатории клеточных культур.
(Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. Практическое руководство. – 2010 г.)
зона стерильных манипуляций
хранение |
препаративная |
зона |
стерилизационная |
зона |
моечная зона
ПРАВИЛА АСЕПТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ В БОКСЕ |
28 |
–Правила асептической работы в боксе:
1)начинайте работу только на совершенно чистой поверхности и после обработки воздуха и внутренних поверхностей бокса УФ-облучением в течение, как минимум, 15 минут;
2)протирайте поверхности камеры бокса безворсовой салфеткой и 70%-м раствором этанола до и после работы;
3)обрабатывайте любые предметы и перчатки перед их внесением в камеру бокса 70%-м раствором этанола;
4)загружайте в рабочую камеру бокса предметы в правильном порядке и только те, которые вам потребуются для планируемой работы;
5)немедленно удаляйте любые загрязнения и пролитые жидкости, протирая затем поверхность 70%-м
этанолом;
6)перед работой в боксе обязательно мыть руки и надевать СИЗ (халат, маску, перчатки).
Правильная загрузка рабочей камеры бокса микробиологической безопасности для правши.
Обработка бокса УФ |
|
Протирание бокса |
|
|
|
Чистая зона |
|
Рабочая зона |
|
Зона сброса |
|
|
|
|
|
|
|
|
чисто |
грязно |
МАНИПУЛЯЦИИ С КУЛЬТУРАЛЬНЫМИ ЕМКОСТЯМИ |
29 |
–Соблюдение следующих правил асептической работы с чашками Петри и многолуночными планшетами минимизирует риск заражения:
Крышка планшета с выступом
1)не оставляйте чашки и планшеты открытыми на продолжительный период, тщательно следите за открытыми чашками и крышками;
2)при передвижении чашек и планшетов по рабочей поверхности и перемещении их в инкубатор или из него старайтесь не наклонять и не трясти чашки и планшеты;
3)используйте вентилируемые чашки и планшеты (с ребрышками); а если среда попала в пространство между чашкой и крышкой, снимите крышку, тщательно удалите среду на наружной поверхности края чашки ватным тампоном, смоченным 70%-м этанолом, и замените крышку на новую.
Убедитесь, что маркировка располагается на дне чашки Петри!
– Правила асептической работы с культуральными флаконами:
1)при перемещении культуральных флаконов не допускайте касания внутреннего жидкого содержимого крышечки;
2)наклоняйте флаконы под небольшим углом при манипуляциях;
3)крышечки флаконов при снятии лучше всего класть набок для избежания их контаминации.
Ребристость
предотвращает скатывание крышечки
АСЕПТИЧЕСКОЕ ДОЗИРОВАНИЕ |
30 |
– Правила асептической работы по дозированию жидкостей:
1)дозирование ртом должно быть категорически исключено!
2)каждое дозирование должно осуществляться одним единственным наконечником и одной единственной серологической пипеткой;
3)дозаторы для малых объемов жидкости следует использовать только при работе с маленькими флаконами;
4)пипетка в дозирующем устройстве должна располагаться в правильном направлении и под правильным углом в вашей руке;
5) кончик серологической пипетки не должен касаться внешней стороны |
|
Обведенные зоны отмечают |
||||||
бутылки или внутренней поверхности бокса. |
потенциальный риск, например, случайное |
|||||||
соприкосновение кончика или середины |
||||||||
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
пипетки с нестерильной поверхностью |
|||
|
|
|
|
|
|
бутылки или стенки бокса |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
открыть |
|
немного |
|
вставить в |
|
снять |
|
|
упаковку |
|
расслоить |
|
дозатор |
|
упаковку |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Порядок подготовки серологической пипетки к работе