ЯГТУ / Профессиональная подготовка специалистов для производства иммунобиологических лекарственных препаратов (вакцин). Направление «Biotechnical» / Лекция №1. Эукариотические клеточные культуры и методы работы с ними (презентация)

–Питательная среда (англ. – culture medium) является наиболее важным компонентом окружающей среды клеток в условиях in vitro, поскольку в ней содержаться необходимые для роста и деления клеток вещества.

–Наиболее часто используемыми коммерческими базальными средами являются:

1)Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640),

2)минимальная среда Игла (Minimum Essential Medium, MEM),

3)среда Игла в модификации Дульбекко (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM),

4)среда Хэма (Ham's F-12 Nutrient Mixture, F-12).

–В состав коммерческих базальных сред входят такие вещества, как протеиногенные аминокислоты, витамины, неорганические соли и глюкоза. Однако базальные среды должны быть дополнены сывороткой.

–В состав сыворотки входят незаменимые аминокислоты, белки, липиды, глюкоза, минеральные элементы, витамины, факторы роста, ингибиторы пролиферации, факторы адгезии, гормоны и др.

–Питательная среда дополненная сывороткой и другими добавками, необходимыми для роста данной конкретной культуры клеток, называется полной питательной средой или ростовой средой.

–Бесцветные питательные среды не содержат в своем составе, а цветные содержат индикатор pH – феноловый красный.

–Для поддержания pH в диапазоне физиологических значений при проведении продолжительных манипуляций

в отсутствии атмосферного CO2 в питательную среду может быть добавлен буфер HEPES в концентрациях 10-20 мМ.

Индикатор pH феноловый красный в стандартном наборе растворов. Крайний слева и крайний справа неприемлемы и требуют немедленного действия — замены среды, субкультивирования или наполнения газом (Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. Практическое руководство. – 2010 г.)

–Для культивирования клеток требуются незаменимые аминокислоты (англ. – essential amino acids), цистин и/или цистеин, аргинин, глутамин и тирозин. Равноценной альтернативой глутамину является добавка Глутамакс (Glutamax), которая представляет собой более стабильный дипептид аланин-глутамин.

–Помимо незаменимых, в питательную среду могут добавляться заменимые аминокислоты (англ. – non-essential amino acids, NEAA).

–Антибиотики, как правило, добавляют в питательную среду для того, чтобы снизить риск контаминации микроорганизмами, в том числе – бактериями, микоплазмой и микроскопическими грибами. Однако антибиотики

обладают рядом серьезных недостатков.

Антибиотики, используемые при культивировании клеток (Фрешни Р.Я., 2010 г.)

–Информацию относительно выбора подходящей среды для данного типа клеток можно найти в литературе – в статьях, где описано получение клеточной линии или сходной культуры клеток, а также можно получить от того, кто предоставляет клеточную линию:

АТСС (Американская коллекция клеток) ЕСАСС (Европейская коллекция клеток)

–Включение в состав среды пирувата позволяет клеткам увеличить продукцию эндогенного СO2, делая их независимыми как от экзогенного СO2, так и от бикарбоната.

–Для большинства клеточных линий человека и теплокровных животных рекомендуется температура окружающей среды 37 °С.

– Культивируемые клетки млекопитающих устойчивы к значительному понижению температуры, они выживают в течение нескольких дней при 4°С и могут быть заморожены и охлаждены до -196 °С, но не выдерживают нагрева выше нормы более чем на 2 °С (39,5°С) более чем на несколько часов и очень быстро погибают при температуре 40°С и выше.

37 °С

5% СО2

углекислота

–Основной культуральной посудой, используемой для культивирования клеток in vitro в масштабах лаборатории, являются культуральные флаконы, чашки Петри и многолуночные планшеты.

–Определяющими факторами при выборе культуральной посуды являются:

1)требуемое количество клеток;

2)характер роста культуры – суспензионный или прикрепленный;

3)необходимость в аэрации или герметизация культуры;

4)порядок забора образцов;

5)характер анализа культуры;

6)стоимость.

–Для монослойных культур количество клеток пропорционально площади поверхности флакона, а для суспензионных количество клеток зависит от объема питательной среды.

–Флаконы маркируют согласно площади рабочей поверхности (например, 25 см2 или 175 см2, а иногда Т25 или Т175 соответственно), в то время как чашки Петри обозначают по их диаметру (т.е. 35 мм, 60 мм или 90 мм).

–Для работы с суспензионными культурами клеток используют культуральную посуду, с маркировкой «non-treated», т.е. «не обработано», а для работы с адгезионными, наоборот – «treated», т.е. «обработано».