ЯГТУ / Профессиональная подготовка специалистов для производства иммунобиологических лекарственных препаратов (вакцин). Направление «Biotechnical» / «Upstream» И «Downstream» биотехнологические процессы.Упражнение в боксе микробиоло

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

УПРАЖНЕНИЕ В БОКСЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ Смена ростовой среды в суспензионной культуре

Цель процедуры:

Заменить истощенную ростовую среду в суспензионной культуре на свежую ростовую среду.

Области применения:

Используется для восполнения объема питательных веществ в ростовой среде между субкультивированием в быстро растущих культурах или при замене одного вида среды на другой.

Краткое изложение процедуры:

Истощенная ростовая среда должна быть отобрана из клеточной культуры, отправлена в емкость для слива и замещена на свежую ростовую среду.

Время выполнения:

15 минут

Материалы:

стерильные пластмассовые градуированные серологические пипетки в индивидуальной упаковке, 5 мл – 4 шт. (одна запасная);

штатив для пробирок – 1 шт.;

стерильная пробирка Eppendorf объемом 15 мл – 1 шт.;

питательная среда DMEM (со смесью антибиотиков стрептомицин-пенициллин) в культуральном флаконе Т25 – 5 мл;

стакан для слива – 1 шт.;

этанол 70% в пульверизаторе;

безворсовые салфетки.

Оборудование:

бокс микробиологической безопасности II класса;

влажный CO2-инкубатор;

центрифуга с ротором для 15 мл пробирок;

автоматический дозатор для серологических пипеток.

Протокол:

1.Вымойте руки с мылом, высушите, наденьте перчатки и обработайте перчатки 70% этанолом. Плавно поместите руки в рабочую камеру заранее подготовленного к работе бокса. Подождите 30 сек – 1 мин для того, чтобы ламинарный поток очистил перчатки.

2.Аккуратно переместите флакон в центральную часть рабочей поверхности бокса, не допуская попадания жидкости в горлышко и на фильтр. Придерживая флакон левой рукой, правой рукой ослабьте крышечку флакона таким образом, чтобы еѐ можно было снять одной левой рукой. Отодвиньте флакон ближе к стенке бокса.

3.Возьмите из штатива 15 мл пробирку, ослабьте крышечку и верните обратно в штатив.

4.Возьмите левой рукой одну серологическую пипетку. Откройте двумя руками упаковку в верхней части пипетки, не касаясь при этом самой пипетки. Неполностью расслоите концы упаковки, поворачивая их снаружи внутрь и не касаясь при этом пипетки. Удерживая в левой руке раскрытую пипетку за ту часть, что находится еще в упаковке, в правую руку возьмите дозатор для серологических пипеток. Удерживая правой рукой дозатор, вставьте левой рукой конец пипетки в адаптер дозатора, не прилагая при этом слишком больших усилий, таким образом, чтобы была видна положительная градуировка (от 0 до 5). Удерживая правой рукой дозатор, левой рукой снимите

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

упаковку с пипетки, не касаясь при этом пипеткой любых нестерильных поверхностей. Обертку уберите в левую часть рабочей поверхности бокса.

5.Левой рукой пододвиньте к себе культуральный флакон и снимите с него крышечку. Положите крышечку резьбой вверх ближе к стенке бокса, так чтобы ваша рука не проходила над ней во время манипуляций.

6.Используя серологическую пипетку, отберите всю ростовую среду из культурального флакона. Затем левой рукой наденьте на флакон крышечку и отодвиньте его ближе к стенке бокса. Левой рукой снимите крышечку с пробирки и положите еѐ на ребро ближе к стенке бокса. Возьмите пробирку в левую руку. Перенесите всю ростовую среду из серологической пипетки в пробирку. Пробирку верните обратно в штатив и накройте крышечкой.

7.Выдуйте остатки ростовой среды из серологической пипетки в стаканчик для слива, так чтобы с носика пипетки не капала жидкость. Левой рукой выньте серологическую пипетку из дозатора. Дозатор поставьте на подставку в крайнюю правую часть рабочей зоны бокса. Серологическую пипетку из левой руки возьмите в правую руку, не допуская перекреста рук. Правой рукой сбросьте использованную серологическую пипетку в стаканчик для слива.

8.Плотно закройте крышечку флакона и пробирки.

9.Возьмите пробирку левой рукой и перенесите еѐ в правую руку. Освободившейся левой рукой возьмите обертку от использованной серологической пипетки. Покиньте рабочую зону бокса. Обертку выбросите в мусорное ведро. Покиньте чистую зону лаборатории клеточных культур и перейдите в лабораторию цитологических исследований.

10.В заранее уравновешенный ротор центрифуги загрузите пробирку. Закройте крышку центрифуги до щелчка (при этом должна загореться зеленая круглая кнопка). Проверьте параметры центрифугирования (300 g, 1 минута). Запустите центрифугу, нажав на зеленую кнопку. По истечении заданного времени, ротор центрифуги остановиться автоматически (при этом будет слышан громкий звуковой сигнал и щелчок). Откройте крышку центрифуги и аккуратно заберите пробирку, не взбалтывая еѐ содержимое. Вернитесь в чистую зону лаборатории клеточных культур.

11.Поставьте пробирку в штатив, находящийся вне бокса, рядом на столе. Включите режим очистки-загрузки бокса. Для этого разблокируйте магнитным ключом бокс. Нажмите на черную кнопку меню «i». С помощью кнопки «стрелочка вниз» выберите режим «Очистка-загрузка» и ещѐ раз нажмите кнопочку «i». Обработайте руки 70% этанолом. Обработайте пробирку 70% этанолом, вытрите излишки спирта с пробирки чистой безворсовой салфеткой. Загрузите пробирку в штатив, находящийся в рабочей зоне бокса. Выключите режим «Очистка-загрузка» бокса. Для этого снова разблокируйте магнитным ключом бокс и нажмите на кнопку «L» (через 2 секунды бокс вернется в рабочий режим). Подождите 1 минуту для того, чтобы ламинарный поток очистил воздух в рабочей камере бокса.

12.Вернитесь в рабочую камеру бокса, как описано в п.1.

13.Ослабьте крышечку пробирки. Вставьте новую серологическую пипетку в дозатор. Отберите из пробирки супернатант, оставив на донышке примерно 500 мкл для того, чтобы случайно не взболтать осадок клеток, и сбросьте его в слив. Верните пробирку в штатив и накройте крышечкой. Серологическую пипетку сбросьте.

14.Ослабьте крышечку исходного культурального флакона. Ослабьте крышечку бутыли со свежей ростовой средой. Вставьте новую серологическую пипетку в дозатор. Добавьте 5 мл свежей ростовой среды к осадку клеток в пробирке, аккуратно ресуспендируйте его, не допуская образования пузырей и пены. Этой же серологической пипеткой отберите из пробирки весь объем полученной клеточной суспензии и перенесите его в исходный культуральный флакон. Накройте крышечкой флакон и отодвиньте его ближе к стенке бокса. Сбросьте серологическую пипетку. Уберите дозатор в крайнюю правую часть

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

рабочей зоны бокса. Плотно закройте крышечку флакона, затем – бутыли с питательной средой, затем – пробирки.

15.Плавными движениями флакона «север-юг» и «запад-восток» распределите суспензию клеток по всей рабочей поверхности флакона, не допуская попадания жидкости в горлышко и на фильтр крышечки.

16.В правую руку возьмите культуральный флакон, в левую – обертки от серологических пипеток и пробирку. Покиньте рабочую зону бокса. Обертки и пробирку выбросите в мусорное ведро. Культуральный флакон поставьте во влажный CO2-инкубатор.

Контролируемые моменты работы:

не допустима загрузка в бокс необработанных 70% этанолом любых рабочих элементов, в т.ч. перчаток оператора;

не допустимо сразу же начинать работу в боксе, предварительно не дав ламинарному потоку очистить перчатки, а спирту полностью испариться;

не допустимо оголение открытых участков кожи рук при работе в боксе;

не допустимо перекрестное движение рук в боксе;

не допустимо движение рук над открытым культуральным флаконом, открытой питательной средой, открытой пробиркой и крышечками, положенными резьбой вверх;

не допустимо касание стерильной серологической пипетки любых нестерильных поверхностей;

не допустимо дозирование разных по составу и чистоте жидкостей одной серологической пипеткой;

не допустимо попадание жидкости внутрь автоматического дозатора;

не допустимо встряхивание пробирки с осажденными клетками;

крайне нежелательно пенообразование и разбрызгивание при дозировании;

крайне нежелательно попадание жидкости на горлышко культурального флакона и на фильтр крышечки;

крайне нежелательно надолго открывать дверцу инкубатора при загрузке в него культурального флакона;

обязательно протирание салфеткой, смоченной 70% этанолом, любых разбрызганных капель на поверхности рабочей зоны бокса незамедлительно после окончания текущей манипуляции;

желательно открытые ѐмкости после работы с ними сразу же накрывать крышечкой.

Дополнительно:

1.Перед началом центрифугирования рассказать главное правило работы с центрифугами

–ротор всегда должен быть загружен уравновешенными пробами, в противном случае это вызовет дисбаланс при его движении, что может привести к вылету ротора с вращающегося вала, что особо опасно при больших центробежных ускорениях. Кроме того, пояснить, что для осаждения клеток достаточно ускорения в 100-300 g в течение 3- 5 минут (в упражнении продолжительность центрифугирования уменьшена до 1 минуты с целью экономии времени).

2.Во время центрифугирования клеточной суспензии продемонстрировать питательные среды, подогреваемые в водяной бане. Рассказать основные правила работы с водяной баней:

перед началом работы обязательно обрабатывать емкость водяной бани 70% этанолом;

использовать для водяной бани всегда свежую и только дистиллированную, желательно стерильную воду;

всегда проверять заданную температуру нагрева воды до 37 ;

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

крайне нежелательно попадание воды на горлышко и крышечку бутылей с реактивами, а при разморозке клеток – на крышечку криовиалы (продемонстрировать криовиалы);

для предотвращения всплывания практически пустых бутылей можно использовать специальные утяжелители или добавлять меньшее количество воды; 15 мл и 50 мл пробирки можно подогревать в штативах, а эппендорфы и криовиалы с помощью плавающих штативов;

время подогрева культуральных реактивов варьируется в зависимости от их объема, как правило, бутыль объемом 500 мл подогревается не более 30 минут;

после подогрева культуральных реактивов в водяной бани их в обязательном порядке необходимо насухо вытереть с помощью чистых бумажных полотенец;

в конце дня обязательно сливать воду из водяной бани и протирать еѐ насухо.

3.Во время очистки воздуха в рабочей камере бокса после загрузки в него пробирки с осажденными клетками продемонстрировать УФ-рециркулятор воздуха и пояснить его предназначение, которое состоит в очистке воздуха ультрафиолетовым излучением для снижения вероятности контаминации клеточных культур из воздуха. Отметить, что рециркуляторы бывают открытого и закрытого типа. При работе первых не допускается нахождение в помещении оператора, поскольку УФ-облучение вызывает ожоги глаз и кожи. В случае закрытых рециркуляторов оператор может одновременно находиться в помещении. Рассказать о том, что время работы рециркулятора рассчитывается с учетом его мощности и объема помещения, однако не должно превышать 30 минут согласно регламентирующему руководству по эксплуатации УФ-рециркуляторов.