ЯГТУ / Профессиональная подготовка специалистов для производства иммунобиологических лекарственных препаратов (вакцин). Направление «Biotechnical» / «Upstream» И «Downstream» биотехнологические процессы. Упражнения практического занятия №1

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

Упражнение №1 ДОЗИРОВАНИЕ ЖИДКОСТЕЙ С ПОМОЩЬЮ МЕХАНИЧЕСКИХ И ЭЛЕКТРОННЫХ

ПИПЕТОЧНЫХ ДОЗАТОРОВ И ДОЗАТОР-НАСОСОВ

Задание №1:

Добавьте 10 мкл питательной среды в каждый из 5 эппендорфов с помощью механического одноканального дозатора с варьируемым объемом от 1 до 10 мкл, предварительно настроив нужный объем. Затем к 10 мкл питательной среды в каждый из 5 эппендорфов добавьте 10 мкл чистой дистиллированной воды с помощью того же дозатора, но нового наконечника и ресуспендируйте полученную смесь в каждом эппендорфе 15 раз, не допуская образования пузырей, пены, и разбрызгивания смеси на стеночки эппендорфа. В случае дозирования и разбрызгивания на стенки эппендорфа, воспользуйтесь микроцентрифугой-вортексом Microspin FV-2400 для осаждения жидкости на дно эппендорфа. После добавления к 10 мкл питательной среды 10 мкл чистой дистиллированной воды и ресуспендирования наконечник необходимо сменять на новый.

Задание №2:

Добавьте 100 мкл питательной среды в каждую из восьми лунок первого ряда А1-H1 96-ти луночного планшета с помощью одноканального механического дозатора с варьируемым объемом от 100 до 1000 мкл, предварительно настроив нужный объем. При дозировании жидкости, наконечник дозатора должен касаться стеночки лунки. Затем, добавьте в каждую из этих лунок 100 мкл чистой дистиллированной воды с помощью того же дозатора, но уже с новым наконечником и ресуспендируйте полученную смесь в каждой лунке планшета 15 раз, не допуская образования пузырей, пены, и вытекания смеси из лунок планшета.

Задание №3:

Добавьте 100 мкл питательной среды в каждую из восьми лунок второго ряда А2-H2 96-ти луночного планшета с помощью одноканального электронного дозатора с варьируемым объемом от 50 до 1000 мкл, предварительно настроив нужный режим дозирования. Для этого:

1)нажмите кнопку Select до появления на дисплее MULTI.

2)«прокручивайте» с помощью кнопки со стрелочками до появления на дисплее символа d.

3)подтвердите нажатием кнопки Enter.

4)выберите необходимый объем дозирования (100 L) с помощью кнопки со стрелочками.

Примечание: если удерживать кнопку со стрелочками нажатой, то значения объема на дисплее будут меняться быстрее.

5)нажмите кнопку Enter или кнопку Select для подтверждения выбора.

6)выберите нужное количество аликвот (8) с помощью кнопки со стрелочками.

7)нажмите кнопку Enter для подтверждения выбора.

8)погрузите наконечник на 2-3 мм под углом 90° в раствор питательной среды для набора жидкости и нажмите синюю кнопку Start. Дозатор наберет в наконечник сумму выбранных аликвот и автоматически выбранный избыточный объем. Избыточный объем необходим для того, чтобы обеспечить одинаковые рабочие условия на каждом этапе дозирования.

9)прислоните наконечник под углом 30-45° к стенке стакана для слива и нажмите синюю кнопку Start для сброса воздуха и небольшого количества избыточного объема жидкости.

10)для дозирования питательной среды прислоните наконечник к стенке лунки А2 многолуночного планшета и нажмите синюю кнопку Start и повторяйте до тех пор, пока цикл не будет завершен.

2

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

11)в конце дозирования (на дисплее отобразиться символ Е) прислоните наконечник к стенке стакана для слива и два раза нажмите синюю кнопку Start.

Затем, добавьте в каждую из этих лунок 100 мкл чистой дистиллированной воды и ресуспендируйте полученную смесь в каждой лунке с помощью того же дозатора, но уже с новым режимом дозирования (для сброса наконечника нажмите любую – левую или правую кнопку с нарисованным на ней наконечником). Для этого:

1)нажмите кнопку Select до появления на дисплее PIPET.

2)«прокручивайте» с помощью кнопки со стрелочками до появления на дисплее символа

P+MIXING.

3)подтвердите нажатием кнопки Enter.

4)выберите необходимый объем дозирования (100 L) с помощью кнопки со стрелочками.

5)нажмите кнопку Enter для подтверждения выбора.

6)погрузите наконечник на 2-3 мм под углом 90° в чистую дистиллированную воду для набора жидкости и нажмите синюю кнопку Start.

7)прислоните наконечник под углом 30-45° к стенке лунки многолуночного планшета, но не погружайте в раствор ранее добавленной питательной среды и нажмите синюю кнопку Start для дозирования жидкости.

8)погрузите наконечник под углом 30-45° в полученную смесь, нажмите и удерживайте синюю кнопку Start в течение 10 секунд. Перемешивание производится автоматически в течение всего времени, пока кнопка Start удерживается. По истечении 10 секунд отпустите кнопку Start, не вынимая при этом наконечник из жидкости.

9)поместите наконечник под углом 30-45° к стенке стакана для слива и два раза нажмите

синюю кнопку Start для продувки наконечника.

Аналогично образом повторить для остальных семи лунок второго ряда многолуночного планшета, при этом каждый раз меняя наконечник на новый.

Задание №4:

Добавьте 120 мкл питательной среды в каждую из восьми лунок третьего ряда А3-H3 96-ти луночного планшета с помощью одноканального электронного дозатора с варьируемым объемом от 50 до 1000 мкл, предварительно настроив нужный режим дозирования. Для этого:

1)нажмите кнопку Select до появления на дисплее MULTI.

2)«прокручивайте» с помощью кнопки со стрелочками до появления на дисплее символа

Ad.

3)подтвердите нажатием кнопки Enter.

4)выберите необходимый объем дозирования (120 L) с помощью кнопки со стрелочками.

5)нажмите кнопку Enter или кнопку Select для подтверждения выбора.

6)выберите нужное количество аликвот (8) с помощью кнопки со стрелочками.

7)нажмите кнопку Enter или кнопку Select для подтверждения выбора.

8)выберите необходимый интервал между дозированиями с помощью кнопки со стрелочками (0.1 секунд).

9)нажмите кнопку Enter для подтверждения выбора.

10)погрузите наконечник на 2-3 мм в раствор питательной среды под углом в 90° и нажмите синюю кнопку Start для набора жидкости. Дозатор наберет в наконечник сумму выбранных аликвот и автоматически выбранный избыточный объем. Избыточный объем необходим для того, чтобы обеспечить одинаковые рабочие условия на каждом этапе дозирования.

11)поместите наконечник под углом 30-45° к стенке стакана для слива и нажмите синюю кнопку Start для дозирования избыточного количества набранной жидкости.

12)для дозирования поместите наконечник под углом 30-45° к стенке лунки многолуночного планшета и нажмите синюю кнопку Start. Дозатор будет дозировать аликвоты с установленным интервалом, поэтому необходимо успевать переносить наконечник в следующую лунку многолуночного планшета.

3

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

13)в конце дозирования (на дисплее отобразиться символ Е) поместите наконечник под углом 30-45° к стенке стакана для слива и два раза нажмите синюю кнопку Start для

дозирования оставшегося избытка жидкости.

Затем, опустошите все восемь лунок третьего ряда А3-H3 96-ти луночного планшета с помощью того же дозатора и того же наконечника, но уже с другим режимом дозирования. Для этого:

1)нажмите кнопку Select до появления на дисплее MULTI.

2)«прокручивайте» с помощью кнопки со стрелочками до появления на дисплее символа

SA.

3)подтвердите нажатием кнопки Enter.

4)выберите необходимый объем набора жидкости (120 L) с помощью кнопки со стрелочками.

5)нажмите кнопку Enter или кнопку Select для подтверждения выбора.

6)выберите нужное количество наборов (8) с помощью кнопки со стрелочками.

7)нажмите кнопку Enter для подтверждения выбора.

8)погрузите наконечник в смесь растворов в лунке планшета под углом в 90° и нажмите синюю кнопку Start для набора жидкости. Повторите это действие до тех пор, пока все восемь лунок не будут опустошены. На дисплее отобразится общий объем.

9)поместите наконечник под углом 30-45° к стенке стакана для слива и нажмите два раза синюю кнопку Start для сброса набранной жидкости.

Задание №5:

Перенести 25 мл питательной среды в ванночку для дозирования многоканальными дозаторами. Добавьте с помощью механического многоканального дозатора 150 мкл питательной среды RPMI-1640 в каждую из оставшихся лунок 96-ти луночного планшета и ресуспендируйте 15 раз, не допуская образования пузырей и вытекания жидкости из лунок планшета.

Задание №6:

Добавьте 2 мл питательной среды в чашку Петри с помощью автоматического дозатора для серологических пипеток Midi Plus и серологической пипетки вместимостью 5 мл. Крышечку держите над чашкой Петри, стараясь полностью еѐ не открывать – таким образом снижается вероятность контаминации клеток, культивируемых в чашках Петри. Плавными движениями «север-юг» и «запад-восток» или по траектории «восьмерки» распределите весь объем питательной среды по всей рабочей поверхности чашки Петри. Затем, той же серологической пипеткой отберите обратно всю питательную среду из чашки Петри и сбросьте еѐ в слив (для удобства чашку Петри необходимо немного наклонить). Сбросьте серологическую пипетку и присоедините новую серологическую пипетку вместимостью 5 мл. Отберите из бутыли 4 мл питательной среды и поочередно добавьте 2 мл питательной среды сначала в одну, а затем во вторую чашки Петри. Плавными движениями «север-юг» и «запад-восток» или по траектории «восьмерки» распределите весь объем питательной среды по всей рабочей поверхности чашек Петри.

Задание №7:

Добавьте 8 мл питательной среды в культуральный флакон с завинчивающейся крышечкой с помощью автоматического дозатора для серологических пипеток Midi Plus и серологической пипетки вместимостью 10 мл. Омойте питательной средой рабочую поверхность флакона 10 раз, не допуская образования пузырей и пены, а также попадания жидкости в горлышко флакона. Закройте крышечку флакона таким образом, чтобы был возможен свободный газообмен. Плавными движениями «север-юг» и «запад-восток» или по траектории «восьмерки» распределите весь объем питательной среды по всей рабочей поверхности флакона, не допуская попадания жидкости в горлышко. Сбросьте использованную серологическую пипетку и присоедините новую серологическую пипетку вместимостью 10 мл.

4

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

Отберите из бутыли 10 мл питательной и поочередно добавьте 5 мл питательной среды сначала в один, а затем во второй культуральный флакон с вентилируемой крышечкой. Плавными движениями «север-юг» и «запад-восток» или по траектории «восьмерки» распределите весь объем питательной среды по всей рабочей поверхности флаконов, не допуская попадания жидкости в горлышко.

5

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

Упражнение №2 СУБКУЛЬТИВИРОВАНИЕ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК

Расходные материалы и реактивы:

–суспензионная культура клеток К-562 в культуральном флаконе 25 см2 – 5 мл;

–питательная среда RPMI-1640, дополненная бычьей сывороткой до еѐ конечной концентрации 10% – 5 мл;

–0,4% раствор трипанового синего в эппендорфе объемом 0,5 мл – 0,01 мл;

–культуральный флакон с необработанной поверхностью 25 см2 – 1 флакон;

–серологические пипетки, 5 мл – 3 шт.;

–наконечники, 1000 мкл – 2 шт.;

–наконечники, 10 мкл – 2 шт.;

–эппендорфы объемом 0,5 мл – 2 шт.

Оборудование:

–инвертированный фазово-контрастный микроскоп;

–стандартный световой микроскоп;

–гемоцитометр (камера Горяева);

–автоматический дозатор-насос для серологических пипеток;

–механический пипеточный дозатор с варьируемым объемом 100-1000 мкл;

–механический пипеточный дозатор с варьируемым объемом 1-10 мкл.

Протокол:

1.Подготовьте гемоцитометр (камеру Горяева) к работе. Для этого нанесите на бороздки камеры Горяева по капельке чистой дистиллированной воды (около 0,5 мкл), накройте бороздки поверх капелек покровным стеклом и большими пальцами с усилием притрите покровное стекло к бороздкам камеры Горяева до появления колец, полос или пятен Ньютона (радужных).

2.Тщательно исследуйте культуру визуально и с помощью инвертированного микроскопа. Определите:

–рН питательной среды;

–мутность питательной среды;

–морфологию клеток.

Оцените:

–концентрацию клеток;

–состояние клеток (вакуолизация, грануляция вокруг ядер, размеры) – клетки, которые находятся в плохом состоянии, характеризуются уменьшением объема, неправильным строением и/или степенью детализации. Здоровые клетки должны быть чистыми и прозрачными с видимым ядром; возможно образование в статической культуре маленьких агрегатов;

–контаминацию культуры клеток во флаконе бактериями, грибами, дрожжами, клеточным дебрисом и другим внеклеточным мусором.

3.Плавными движениями флакона по поверхности стола в направлении «север-юг» и «запад-восток» или по траектории «восьмерки» равномерно распределите клетки по всему объему жидкой питательной среды, стараясь при этом не допускать попадания жидкости в горлышко и на фильтр.

4.С помощью механического пипеточного дозатора с варьируемым объемом 100-1000 мкл отберите из культурального флакона аликвоту суспензии клеток 100 мкл, предварительно 25 раз ресуспендировав для лучшего распределения клеток. При этом не допускайте, чтобы нестерильные части дозатора касались внутренних поверхностей

6

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

флакона (касаться можно только наконечником). Отобранную аликвоту перенесите в эппендорф.

5.Из полученной аликвоты отберите 10 мкл клеточной суспензии с помощью механического пипеточного дозатора с варьируемым объемом 10-100 мкл, предварительно 25 раз ресуспендировав, и перенесите отобранные 10 мкл в новый эппендорф.

6.Добавьте 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего к 10 мкл клеточной суспензии и 25 раз ресуспендируйте, не допуская образования пузырей и пены.

7.Из полученной смеси клеток с трипановым синим тем же наконечником отберите 10 мкл

ивнесите их в одну ячейку камеры Горяева. Для этого наконечник нужно поднести к краю покровного стекла и плавно нажать плунжер. За счет капиллярного эффекта жидкость попадет в ячейку и равномерно распределиться в ней. Для заполнения ячейки камеры Горяева нужно меньше 10 мкл (около 7 мкл).

8.С помощью светового микроскопа при малом увеличении (10х) посчитайте окрашенные

инеокрашенные трипановым синим клетки в 20 больших квадратах камеры Горяева с учетом правила Егорова.

9.Полученное количество клеток переведите в общую концентрацию клеток и концентрацию живых клеток и рассчитайте процент живых клеток с помощью формул:

где С общее – концентрация всех клеток в исходном культуральном флаконе, кл/мл;

N общее – кол-во подсчитанных окрашенных и неокрашенных трипановым синим клеток в 20-ти больших квадратах, кл; 250000 – обратная величина объѐма камеры над одним большим квадратом, мл;

Р – разведение суспензии клеток (Р=2 из-за разведения с трипановым синим в соотношении 1:1).

20 – кол-во больших квадратов.

7

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

где С живых – концентрация всех клеток в исходном культуральном флаконе, кл/мл;

N живых – кол-во подсчитанных неокрашенных трипановым синим клеток в 20-ти больших квадратах, кл; 250000 – обратная величина объѐма камеры над одним большим квадратом, мл;

Р – разведение суспензии клеток (Р=2 из-за разведения с трипановым синим в соотношении 1:1).

20 – кол-во больших квадратов по диагонали.

n живых =

n живых – доля живых клеток в исходном флаконе, %.

10.Рассчитайте аликвоту клеточной суспензии, которую необходимо отобрать из исходного

флакона для субкультивирования в новый культуральный флакон таким образом, чтобы концентрация клеток в новом флаконе стала равной 105 кл/мл при желаемом объеме свежей ростовой среды. Обычно отношение объема ростовой среды к рабочей площади поверхности флакона составляет (0,2 0,5) мл/см2.

11.Отберите из исходного флакона рассчитанную аликвоту клеточной суспензии с помощью автоматического дозатор-насоса и серологической пипетки и перенесите аликвоту в новый культуральный флакон, стараясь не задевать носиком серологической пипетки горлышко флакона.

12.Добавьте в новый культуральный флакон к аликвоте клеточной суспензии свежую ростовую среду в нужном количестве и ресуспендируйте, не допуская образования пузырей и пены. Закройте флакон и плавными движениями флакона по поверхности стола в направлении «север-юг» и «запад-восток» или по траектории «восьмерки» равномерно распределите весь объем жидкости по рабочей поверхности флакона, не допуская попадания жидкости в горлышко и на фильтр крышечки.

13.Оцените результат субкультивирования суспензионной клеточной культуры под микроскопом.

8

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

Упражнение №3 СУБКУЛЬТИВИРОВАНИЕ АДГЕЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК

Расходные материалы и реактивы:

–адгезионная культура клеток HEK-293 в культуральном флаконе 25 см2 – 5 мл;

–питательная среда DMEM, дополненная бычьей сывороткой до еѐ конечной концентрации 10% – 5 мл;

–раствор Дульбекко без Ca и Mg – 5 мл;

–раствор трипсин-Версена (в соотношении 1:1) – 1,5 мл;

–0,4% раствор трипанового синего в эппендорфе объемом 0,5 мл – 0,01 мл;

–культуральный флакон с обработанной поверхностью 25 см2 – 1 флакон;

–серологические пипетки, 5 мл – 7 шт.;

–наконечники, 10 мкл – 2 шт.;

–эппендорфы объемом 0,5 мл – 2 шт.;

–слайды для автоматического счетчика клеток – 1 шт.

Оборудование:

–инвертированный фазово-контрастный микроскоп;

–стандартный световой микроскоп;

–автоматический счетчик клеток;

–автоматический дозатор-насос для серологических пипеток;

–механический пипеточный дозатор с варьируемым объемом 1-10 мкл.

Протокол:

1.Тщательно исследуйте культуру визуально и с помощью инвертированного микроскопа. Определите:

–рН питательной среды;

–мутность питательной среды;

–морфологию клеток.

Оцените:

–процент конфлюентности;

–состояние клеток (наличие митотических клеток, многослойности, открепления клеток от субстрата);

–контаминацию культуры клеток во флаконе бактериями, грибами, дрожжами, клеточным дебрисом и другим внеклеточным мусором.

2.Отберите всю старую ростовую среду из исходного флакона с помощью автоматического дозатор-насоса и 5 мл серологической пипетки, стараясь при этом не задевать носиком пипетки слой клеток. Слейте отобранную старую ростовую среду в стакан для слива, прислоняя при этом носик серологической пипетки к стенке стакана для предотвращения разбрызгивания.

3.Добавьте раствор Дульбекко в исходный культуральный флакон из расчета 0,2 мл/см2, направляя струю жидкости на сторону, противоположную прикрепленным клеткам так, чтобы избежать смещения клеток. Произведите плавными движениями и покачиваниями флакона осторожное полоскание клеток и удалите раствор Дульбекко из флакона той же серологической пипеткой, и сбросьте в слив. Этот шаг предназначен для удаления остатков сыворотки, которая ингибирует действие трипсина и истощает двухвалентные катионы, необходимые для прикрепления клеток.

4.Добавьте раствор трипсин-Версена в исходный культуральный флакон из расчета 0,1 мл/см2, направляя струю жидкости к стороне флакона, противоположной расположению

9

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

клеток. Плавными осторожными движениями покачайте флакон так, чтобы весь монослой клеток был покрыт раствором трипсин-Версена. Оставьте флакон в таком состоянии при комнатной температуре для открепления клеток в течение 10 минут.

5.По истечении 10 минут проверьте открепление клеток визуально – плавно покачайте флакон несколько раз, при этом должны быть видны скопления клеток белесого цвета, а затем посмотрите под микроскопом – клетки должны плавать в толще ростовой среды в виде крупных конгломератов.

6.Добавьте свежую ростовую среду (0,1 мл/см2) в культуральный флакон с открепленными клетками и смойте клетки многократным пипетированием по поверхности, на которой рос монослой, а затем интенсивно ресуспендируйте, не допуская образования пузырей и пены. По завершении ресуспендирования оставьте небольшое количество клеточной суспензии в носике серологической пипетки и перенесите его в эппендорф. Проверьте результат диспергирования клеток под микроскопом – должна получится суспензия одиночных клеток. Если такая суспензия не получилась, повторить процедуру ресуспендирования до тех пор, пока не будет получена суспензия одиночных клеток.

7.Из эппендорфа с клеточной суспензией отберите 10 мкл, предварительно ресуспендировав 25 раз, и перенесите в новый эппендорф. К 10 мкл клеточной суспензии добавьте 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего и ресуспендируйте полученную смесь 25 раз. Из полученной смеси клеток с трипановым синим в течение 5 минут тем же наконечником отберите 10 мкл и внесите их в ячейку слайда для подсчета клеток на автоматическом счетчике. Для этого кончик наконечника необходимо прислонить под углом 30-45° к центру дуги ячейки и плавно нажать на плунжер дозатора. За счет капиллярного эффекта жидкость попадет в ячейку слайда.

8.Держа слайд за края и не касаясь его оптической поверхности, простым движением вставьте до упора слайд в отверстие для слайда на лицевой стороне счетчика до появления на дисплее слова «Focusing». В случае, если слайд вставлен неполностью, счетчик не определит слайд и не начнет подсчет клеток. Счетчик клеток автоматически определяет слайд, после чего начинает подсчет клеток (что занимает не более 30 секунд). Не извлекайте слайд, пока прибор не закончит подсчет клеток. По истечении 30 секунд (или менее) на дисплее отобразятся результаты подсчета клеток (Current count):

общее кол-во кл/мл (Total count);

кол-во живых кл/мл (Live count);

процент живых клеток (Live cells).

Перепишите полученные значения в тетрадь. Извлеките слайд из счетчика клеток.

9.Рассчитайте аликвоту клеточной суспензии, которую необходимо отобрать из исходного

флакона для субкультивирования в новый культуральный флакон таким образом, чтобы концентрация клеток в новом флаконе стала равной 104 кл/см2.

10.Отберите из исходного флакона рассчитанную аликвоту клеточной суспензии с помощью автоматического дозатор-насоса и серологической пипетки и перенесите аликвоту в новый культуральный флакон, стараясь не задевать носиком серологической пипетки горлышко флакона.

11.Добавьте в новый культуральный флакон к аликвоте клеточной суспензии свежую ростовую среду (0,2 0,5) мл/см2 и ресуспендируйте, не допуская образования пузырей и пены. Закройте флакон и плавными движениями флакона по поверхности стола в направлении «север-юг» и «запад-восток» или по траектории «восьмерки» равномерно распределите весь объем жидкости по рабочей поверхности флакона, не допуская попадания жидкости в горлышко и на фильтр крышечки.

12.Оцените результат субкультивирования адгезионной клеточной культуры под микроскопом.

10