ЯГТУ / Профессиональная подготовка специалистов для производства иммунобиологических лекарственных препаратов (вакцин). Направление «Biotechnical» / Теория по лекции №5 Основы иммунобиотехнологии
.pdfТак примером классического вертикального биореактора служат:
STR-системы могут быть использованы для культивирования суспензионных и адгезионных культур; клеток, выращенных на микроносителях или суспендированных в среде. Самые крупные аппараты имеют объем 20–30 тыс. л.
Преимуществом систем STR является опыт их масштабирования и использования, накопленный за многие десятилетия использования для различных целей. Хорошо изученная гидродинамика этих систем.
Биореакторы волнового типа (биореакторная система WAVE)
Биореакторная система WAVE уже использовалась для выращивания клеток животных, насекомых и растений. В основе работы этих систем - волновое возбуждение, вызываемое раскачивающими движениями платформы, на которой закреплен одноразовый мешок. Такая система перемешивания обеспечивает хорошее распределение питательных веществ по объему среды, эффективный перенос кислорода без образования пузырьков газа, что важно для культур на микроносителях. Кроме того, данная система удобнее в работе, чем STR. Наибольший разработанный масштаб таких систем - 500 л. Биореактор одноразовый и поэтому не требует очистки или стерилизации.
Основным недостатком является ограниченная способность массопереноса кислорода, что ограничивает масштабируемость процессов максимум до 500 л при низкой плотности клеток.
Для успешного проведения процесса культивирования и достижения высокого уровня накопления целевого биотехнологического продукта, необходимо соблюдать ряд важных условий, комплексно влияющих на синтез конечного продукта.
Следует отметить, что животные клетки уступают прокариотическим по продуктивности, а также по достигаемой концентрации конечного продукта в среде. Более того, культивировать животные клетки гораздо труднее, из-за сложного состава среды, механической непрочности животных клеток, а также их свойством расти преимущественно на поверхностях (адгезионно). Поэтому следует уделять особое внимание факторам, влияющим на ферментацию клеток млекопитающих. Из них можно выделить: скорость перемешивания (покачивания), объем среды, тип клеток и размер посевного материала, pH, температуру, концентрацию O2 и CO2, окислительновосстановительный потенциал и состав питательной среды (концентрация основных источников питания)
Состав среды. В промышленности применяются в основном синтетические среды, в основе которых имеется смесь неорганических солей, главной функцией которых является сохранение pH и осмотического давления среды. Также в состав сред входят сахара (например, глюкоза), витамины, необходимые аминокислоты и другие компоненты. Иногда к синтетическим средам добавляют биологические жидкости, такие как сыворотка или тканевые экстракты, которые обеспечивают клетки гормонами, ростовыми факторами, факторами адгезии, белками, микроэлементами и другим. Наиболее часто добавляемый
агентом для культивирования животных клеток является фетальная бычья сыворотка
(ФБС).
pH для культивирования клеток млекопитающих поддерживают, как правило, на уровне 7,2
– 7,4. Поддержание pH чаще всего обеспечивают с помощью буферных систем (NaHCO3 / HEPES) и поддержанию концентрации CO2, или с помощью добавления в процессе щелочей/кислот.
Концентрация CO2, оптимальная для выращивания животных клеток составляет 5-6%, фактически регулируется содержанием NaHCO3 в питательной среде или HEPES (при этом 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота обладает большей буферной емкостью, чем бикарбонатная система, и обеспечивает стабильный уровень рН среды в диапазоне рН 7,2–7,4 даже в условиях культивирования клеток вне CO2 инкубатора, но данная кислота может негативно влиять на некоторые виды клеток, что необходимо учитывать при использовании определенных культур).
Концентрация кислорода чаще всего поддерживается на физиологическом уровне 25-30%. Температура, при которой обеспечивается оптимальный рост культур клеток животных лежит в пределах 36 – 37,5 ͦС.
Общая схема производства аденовирусов включает следующие этапы:
-выращивание клеток до желаемой плотности клеток для заражения;
-заражение определенным количеством аденовирусов при заранее определенной множественности заражения (MOI);
-Завершается процесс выделением вирусного вектора в строго определенное время после инфицирования клеток.
Для промышленного производства отдается преимущество синтетическим средам, которые не содержат продуктов животного происхождения (в таких условиях проще стандартизировать условия проведения процесса). При MOI больше 1 (обычно от 5 до 10) происходит заражение всех культивируемых клеток. Температура культивирования поддерживается на уровне 37 градусов Цельсия, оптимальный pH = 7,2 – 7,3 при насыщении кислородом, поддерживаемом на уровне выше 30%.
Следует отметить, что после инфицирования клеток вирусом, замедляется их размножение и рост, однако возрастает потребление глюкозы и кислорода в первые 24 часа после инфицирования (что может быть связано с увеличением энергетических затрат на репликацию вирусов в клетках).
Сборка вирусных частиц и ДНК происходит в промежуток времени от 20 до 48 часов после инфицирования. При этом важно прекратить процесс ферментации до лизиса клеток (иначе процесс очистки будет затруднен). Для оценки этого критерия процесс прекращают при жизнеспособности клеток на уровне 80% - 40%. Временные параметры, а также жизнеспособность клеток сильно зависят от MOI, чем он выше, тем быстрее клетки будут гибнуть и разрушаться.
Максимальный титр вирусных частиц достигается примерно через 40-48 часов после инфицирования (и в это же время начинают гибнуть клетки), при этом максимальная
плотность клеток, которую достигали при культивировании - 8*106 кл/мл. Однако с высокими затратами на подкормки или смену питательной среды связано ограничение на плотность клеток примерно в 2*106 кл/мл, при которой прекращают ферментацию. Дальнейшее наращивание биомассы инфицированных клеток экономически нецелесообразно.