ЯГТУ / Профессиональная подготовка специалистов для производства иммунобиологических лекарственных препаратов (вакцин). Направление «Biotechnical» / Теория по лекции №5 Основы иммунобиотехнологии

Искусственный иммунитет можно вызвать двумя основными путями. Первый предполагает обеспечение контакта с болезнетворным началом, осуществляемого таким образом, чтобы иммунная система получила возможность специфически на него отреагировать, но при этом в организме не развились симптомы заболевания в той степени, которая характерна для возникшей естественным путем болезни. Такой вариант называют активным, поскольку в организме вакцинируемых в результате развившегося иммунного ответа сохраняются клетки иммунной памяти и при последующих контактах с таким же возбудителем организм отвечает выработкой антител. Такая форма иммунитета, как правило, сохраняется в течение нескольких лет.

Вторая же форма искусственного иммунитета создается путем введения в организм уже готовых, выработанных в другом организме антител против конкретного возбудителя. Такой, создаваемый с помощью содержащих антитела препаратов (их обычно называют сыворотками) искусственный иммунитет, называют пассивным.

ВОЗ признала наилучшим методом профилактики инфекционных заболеваний человека - вакцинацию. Высокая эффективность, простота, возможность широкого охвата вакцинируемых лиц с целью массового предупреждения заболевания вывели активную иммунопрофилактику в большинстве стран мира в разряд государственных приоритетов.

Первоначальный смысл понятия вакцина заключен в следующем определении.

Вакцинами называют препараты, предназначенные для формирования иммунологической памяти и протективного иммунитета к антигенам возбудителей, минуя стадию инфекционного заболевания.

Вакцинацией называют способ создания протективного иммунитета с помощью вакцин.

Расширенное употребление термина вакцины (в отношении препаратов с противоопухолевой, противоаллергической активностью или направленных на лечение аутоиммунных заболеваний) заставляет несколько изменить акценты.

В этом, новом смысле под вакцинами следует понимать препараты, содержащие

антигенный материал, направленные на предотвращение и лечение инфекционных, опухолевых процессов, а также проявлений гиперчувствительности путем индукции эффекторных клеток и клеток памяти, оказывающих защитное действие.

В настоящее время выделяют 4 поколения вакцин, подразделенных на классы -

которые отличаются по способу получения, эффективности, частоте возникновения побочных реакций и другим параметрам.

К препаратам первого поколения относятся вакцины, основу которых составляют живые ослабленные или убитые (инактивированные) вакцины. Это корпускулярные вакцины. Препаратами второго поколения являются вакцины, состоящие из отдельных фракций возбудителей или их продуктов. К ним относятся

-сплит-вакцины

-субъединичные вакцины

-анатоксины

-конъюгированные вакцины

Третье поколение препаратов составляют рекомбинантные вакцины.

Наконец, к вакцинам четвертого поколения, ещё не внедренным впрактику

здравоохранения, относятся пептидные

-антиидиотипические вакцины,

-ДНК вакцины,

-вакцины, содержащие продукты генов главного комплекса гистосовместимости

-вакцины полученные на трансгенных растениях.

Давайте подробнее остановимся на вакцинах третьего поколения -векторных вакцинах.

В результате последних достижений в области молекулярной биологии и генной инженерии стало возможным создавать живые рекомбинантные векторы, способные доставлять гетерологичные антигены путем введения генов, кодирующих антиген. Идея этого подхода заключается в использовании способности к инфицированию и иммунологических свойств живого вектора для того, чтобы вызвать иммунный ответ против его собственных белков, а также в отношении представленного гетерологичного белка.

Давайте коротко охарактеризуем сами вирусы, итак, вирусы — это неклеточные организмы обычно величиной от 0,02 до 0,3 мкм имеющие внешнюю белковую оболочку, называемую капсидом, а иногда и липидную оболочку называемую супер капсидом, нуклеиновые кислоты, представленные РНК или ДНК и иногда несколько ферментов необходимые для первых этапов репликации вируса.

Вирусы являются облигатными или проще говоря обязательными внутриклеточными паразитами, то есть вне клеток хозяина размножаться они не могут, следовательно, для своего размножения вирусам необходимо проникнуть внутрь клеток организма хозяина, однако просто проникнуть в клетку для вирусов мало так как у вирусов отсутствует собственный аппарат, отвечающий за синтез белка, вирусы используют для этих целей ресурсы клетки хозяина, а что бы использовать белок синтезирующий аппарат клетки хозяина вирусам необходимо интегрировать свой геном в геном клетки хозяина, уже после чего клетка начинает производить компоненты вируса которые собираются в цитоплазме клетки в новые вирусные частицы.

На основе названых ранее особенностей вирусов, были разработаны вирусные векторы, представляющие собой инструменты, используемые для доставки генетического материала в клетки, в свою очередь доставка генетического материала при вакцинации необходима для дальнейшей экспрессии антигена клетками организма хозяина, подвергнутыми воздействию вирусного вектора.

Основными параметрами, характеризующими вектор, являются:

Способность вектора интегрироваться в геном, так вирусные векторы могут интегрироваться в хроматин клетки-хозяина (в случае использования векторов, созданных на основе лентивирусов и онкоретровирусов) или сохранятся в ядре клетки преимущественно в виде внехромосомных эписом (в случае векторов созданных на основе аденовирусов, аденоассоциированных вирусов и цитомегаловирусов).

Диапазон типов клеток, подлежащих заражению, так некоторые вирусные векторы способны к заражению лишь делящихся клеток, в то время как другие способны к заражению как делящихся, так и не делящихся клеток

Размер генома, различные вирусы обладают различными размерами генома, это отражается и на таком понятии как емкость вектора, так чем больше изначальный геном вируса, тем большее количество последовательностей интересующих нас генов может быть вставлено, в вирусный вектор

Между доступными вирусными векторами есть множество различий. Их можно классифицировать по типу вириона (ДНК или РНК), размеру частиц, способности

трансгена и тропизму клеток. Вирусные векторы могут быть реплицирующимися или не реплицирующимися вирусами;

Наиболее распространенными вирусными векторами являются:

Ретровирус представляет собой оболочечный одноцепочечный РНК-вирус, содержащий обратную транскриптазу. Ретровирусные векторы обычно являются дефектными по репликации, и большинство из них имеют мышиное или птичье происхождение. Наиболее широко из них исследован вирус лейкемии мышей Молони (MoMLV). Ретровирусы требуют интеграции генома для экспрессии генов. Таким образом, ретровирусные векторы, обеспечивают долговременную экспрессию генов. Размер генома составляет приблизительно 7–11 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н), и вектор может легко содержать вставки чужеродной ДНК длиной 7–8 тысяч пар нуклеотидов. Ретровирусы обладают низкой иммуногенностью, и у большинства пациентов не обнаруживается ранее существовавший иммунитет к ретровирусным векторам. Однако ретровирусы связаны с различными заболеваниями. Например, вирус лейкемии мышей Молони вызывает лейкемию и лимфому, хотя и является видоспецифичным.

Лентивирусы составляют подкласс ретровирусов. Лентивирусы инфицируют как неделящиеся, так и делящиеся клетки, тогда как ретровирусы инфицируют только делящиеся клетки. Таким образом, лентивирусы обычно демонстрируют более широкий тропизм, чем ретровирусы. Некоторые белки, такие как tat и rev, регулируют репликацию лентивирусов. Эти регуляторные белки отсутствуют у ретровирусов. Хотя лентивирусы потенциально могут запускать онкогенез, риск ниже, чем у ретровирусных векторов, поскольку сайты интеграции лентивирусов находятся далеко от сайтов, несущих клеточные промоторы. Остальные преимущества лентивирусных векторов аналогичны преимуществам ретровирусных векторов. На основе ВИЧ являющегося хорошо известным лентивирусом, был создан вектор доставки трансгена.

Аденоассоциированный вирус – это небольшой вирус с одноцепочечной ДНК, у которого отсутствует оболочка. На его основе был создан непатогенный вирусный вектор; вирус имеет низкую иммуногенность и никогда не проявлял патогенности. Геном аденоассоциированного вируса интегрируется в геном человека в определенном участке хромосомы. Векторы на основе аденоассоциированного вируса обеспечивают долговременную экспрессию трансгена. Вирус может инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки и имеет широкий тропизм для многих различных типов клеток.

Было обнаружено двенадцать серотипов аденоассоциированного вируса у людей и более 100 серотипов аденоассоциированного вируса у различных видов животных, включая нечеловеческих приматов, собак и птиц. \

Каждый серотип имеет уникальные рецепторы, а тканевая специфичность определяется серотипом капсида.

Обычно рекомбинантные векторы Аденоассоциированного вируса получают путем делеции кодирующих областей Rep и Cap между инвертированными концевыми повторами. Эти области используются для экспрессии эндогенного трансгена. Из-за делеции этих областей векторы Аденоассоциированного вируса не могут интегрироваться в геном хозяина, и их ДНК сохраняется в эписомальной форме. Эта предпочтительная особенность векторов Аденоассоциированного вируса повышает их профиль безопасности путем предотвращения начала онкогенеза. Вектор Аденоассоциированного вируса имеет трансгенную емкость приблизительно 4,5 т.п.н., что ниже, чем у других

вирусных векторов, включая вирус герпеса (30 т.п.н.), аденовирус (8–10 т.п.н.) и ретровирус (7-8 т.п.н.).

Другим перспективным вирусом является Цитомегаловирус. Цитомегаловирус (ЦМВ) является членом герпесвирусов. Выявлено несколько видоспецифичных Цитомегаловирусов. Среди них наиболее тщательно изучен Цитомегаловирус человека (HCMV), также известный как вирус герпеса человека 5 типа. Цитомегаловирус человека содержит геном двухцепочечной линейной ДНК длиной 235 т.п.н., окруженный капсидом. Оболочка содержит гликопротеины gB и gH, которые связываются с клеточными рецепторами. Цитомегаловирус часто остается незамеченным, потому что его патогенность у иммунологически здоровых людей легкая. Патогенез представляет опасность только у беременных женщин и лиц с ослабленным иммунитетом.

Аденовирусы представляют собой семейство ДНК-содержащих вирусов позвоночных, не имеющих липопротеиновой оболочки обычно вызывающие легкие инфекции верхних или нижних дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта или конъюнктивы

Геном аденовируса кодирует примерно 35 белков, которые экспрессируются в двух основных фазах: «ранняя», которая происходит примерно через 7 часов после заражения, то есть до инициации репликации вирусной ДНК, и «поздняя», которая происходит после инициации репликации ДНК.

Примерно 20 ранних белков обладают регуляторными функциями, которые позволяют вирусу контролировать клетку и осуществлять репликацию вирусной ДНК. Поздние гены

– это в основном структурные белки вируса. Вирионы собираются в ядре, начиная примерно через 1 день после заражения, и через несколько дней клетка лизируется с выделением инфекционного вируса. Около 10 000 вирионов потомства продуцируются в пермиссивных клетках.

Человеческие аденовирусы повсеместно распространены, и большинство людей инфицировано одним или несколькими серотипами, что приводит к пожизненному иммунитету. Инфекция может протекать бессимптомно или приводить к заболеванию, которое обычно протекает в легкой форме у иммунокомпетентных людей.

Всего существует по меньшей мере 57 серотипов человеческих аденовирусов, которые образуют семь «видов» A – G. Все серотипы похожи по общей структуре и функциям большинства белков, но определенные уникальные функции белков вносят вклад в уникальные свойства серотипа и вида.

В то время как большинство аденовирусных инфекций протекают в легкой форме, аденовирус может быть опасным для людей с ослабленным иммунитетом, особенно у пациентов с трансплантатами, у которых аденовирус, вероятно, реактивируется в результате латентных или устойчивых инфекций низкой степени тяжести. Например, у пациентов с трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток заболеваемость аденовирусами колеблется от 3% до 47%. При трансплантации аллогенных стволовых клеток заболеваемость составляет от 9% до 14% среди взрослых и от 20% до 47% среди детей. У пациентов с трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток аденовирусы могут вызывать респираторные заболевания, колит, гепатит, геморрагический цистит, кератоконъюнктивит и диссеминированные инфекции. Диссеминированные инфекции и,

как правило, летальность могут возникать у пациентов с тяжелой лимфопенией (менее 300 клеток / мкл).

С человеческими векторами аденовируса было или проводится более 400 испытаний генной терапии, большинство из которых предназначены для лечения рака, но некоторые из них предназначены для использования векторов аденовируса в качестве вакцин, в которых вектор экспрессирует чужеродный антигенный белок. Кроме того, миллионы призывников ранее были успешно иммунизированы против острых респираторных заболеваний путем введения в желудочно-кишечный тракт живых вакцин аденовируса серотипов 4,7 в форме капсул с энтеросолюбильным покрытием.

Аденовирусные векторы имеют множество преимуществ так, например, аденовирусные векторы хорошо изучены, аденовирусные векторы можно выращивать в стабильные запасы с высоким титром, они инфицируют неделящиеся и делящиеся клетки разных типов и сохраняются в клетках как эписомы, почти все клинические испытания показали, что аденовирусные векторы безопасны и хорошо переносятся.

Из всех существующих подтипов человеческого аденовируса, аденовирус серотипа 5 является наиболее охарактеризованным и наиболее часто используется в испытаниях вакцин. Аденовирус серотипа 5 - это стабильный нереплицирующийся вирус, характеристики которого способствуют его безопасному применению. Этот вирус позволяет встраивать в свой геном большие сегменты чужеродной ДНК (около 8 т.п.н.), и, кроме того, он может быть получен с высокими титрами и легко очищен.

Стоит так же отметить, что применение генно-инженерных вакцин на основе аденовируса серотипа 5 может быть ограничено наличием предсуществующего иммунного ответа у людей, уже встречавшихся ранее с этим вирусом (а это достаточно большая часть популяции людей – в зависимости от региона варьирующаяся от 45 до 90%)

Так как большинство людей подвергались воздействию аденовируса, наличие ранее существовавшего иммунитета против аденовируса является недостатком вектора. Для решения данной проблемы поступают следующим образом аденовирус содержит три основных структурных белка: гексон, пентон и волоконный белок. Эти белки являются основными мишенями гуморального и клеточного иммунного ответа против аденовируса серотипа 5. Антитела против гипервариабельных участков (HVR) гексонового белка доминируют в нейтрализующих ответах. Модификация этих гипервариабельных участков и домена волоконных выступов была исследована как способ избежать ранее существовавшего иммунитета.

Большинство аденовирусных-векторов являются генетически модифицированными версиями аденовируса пятого серотипа, и они бывают двух типов: репликационнодефектные (RD) и репликационно-компетентные (RC). Репликационно-дефектные векторы в свою очередь подразделяются на хелпер-зависимые и хелпер независимые.

Таким образом,в зависимости от особенностей строения получаемого вектора и способа его полученияможно выделить две основные линии технологического процесса при в производстве аденовирусных векторов:

Первая из которых предполагает использование хелперных вирусов или плазмид

Второе – на основе стабильной производственной линии

Самая распространенная и наиболее документированная упаковывающая клеточная линия для аденовирусных векторов - это культура почек эмбриона человека HEK293, которая содержит область E1 аденовируса . Упаковка клеток на основе клеточной линии 293 является универсальной, и их можно выращивать в виде адгезионных или суспензионных культур в различных вариациях питательной среды.

Ферментация – главная продуктивная стадия БТ процесса, т.к. на ней образуется целевой продукт.

Под ферментацией понимают любой процесс выращивания биологического объекта в питательной среде в определенных условиях в результате которого образуется биотехнологический продукт.

Для максимального синтеза целевого продукта, помимо подбора оптимальных условий самой ферментации, необходимо также обеспечения оптимального прохождения предварительных этапов подготовки.

Условия максимального синтеза биотехнологического продукта:

Приготовление качественной и стерильной питательной среды

Приготовление активного посевного материала

Проведение процесса в специальных биореакторах – ферментаторах

Поддержание стерильности (соблюдение асептичных условий) – отсутствие посторонних микроорганизмов в процессе ферментации

Поддержание оптимальной t°

Поддержание оптимального PH

Обеспечение культуры продуцента необходимым газообменом (кислород, углекислый газ, если необходимо)

Подготовка питательной среды.

Для культивирования клеток млекопитающих в промышленных масштабах используют питательные среды с тем же составом, что и при культивировании в лабораторных

условиях (MEM, DMEM, RPMI, BME, IMDM). В состав сред может входить сыворотка, так же существуют технологии, при которых используют бессывороточные среды. В зависимости от типа клеток, может появиться необходимость в добавлении дополнительных компонентов (витамины, ростовые факторы и т.д.)

В зависимости от состава питательной среды, сложности и типа стерилизации оборудования, способа ферментации и необходимости добавок, возможны разные способы добавления питательных сред в ферментатор.

Готовая питательная среда (купленная или заранее приготовленная и простерилизованная) может находиться в пакетах или бутылках рядом с ферментатором. Подвод питательной среды осуществляется с помощью дополнительных приспособлений ферментатора. Удобно использовать при необходимости доливов, а так же если состав среды очень сложный и ы нем присутствуют термолабильные вещества. Стерилизация оборудования проводится отдельно.

Подготовка посевного материала.

Засеву посевного материала в ферментатор предшествует много этапов подготовки посевного материала. Самым основным является наращивание клеточной биомассы до определенных объёмов и концентрации клеток, так как состояние клеток, скорость синтеза и выход продукта зависит от соотношения количества клеток и объемов питательной среды.

После наращения посевного материала в достаточном объеме и концентрации осуществляется его аспетичный пересев в ферментатор.

На производстве можно выделить различные способы культивирования клеточных линий, в зависимости от способа их масштабирования.

Так единичные технологические системы характеризуются масштабируемостью за счет увеличения размера / объем системы культивирования («биореактор»), тогда как

системы для множественного культивирования, характеризуются масштабируемостью

за счет увеличения количества идентичных системы культивирования (например, увеличение количества роллерных бутылок или элементов клеточных фабрик).

У различных биореакторов существуют свои конструктивные особенности, однако в общем и целом все они обеспечивают для биотехнологического процесса соблюдение следующих параметров:

Соответствующая конструкция ферментатора

Поддержание стерильности

Поддержание постоянства темперратуры

Постоянство pH

Оптимальный газообмен

Оптимальное распределение питательных веществ по всему рабочему объему ферментатора

отвод метаболитов

•Соответствующая конструкция ферментатора;

При подборе аппарата всегда учитывается характеристика выращиваемой культуры, а также ее морфологическое строение: способность к адгезии, образованию агрегатов и тому подобное.

•Стерильность культуры, отсутствие контаминантов

Отсутствие посторонней микрофлоры (стерильность процесса) при выращивании продуцентов биологически активных веществ является одним из наиболее важных факторов любого биотехнологического процесса. Посторонние микроорганизмы, развиваясь в питательной среде, видоизменяют ее и тем самым нарушают оптимальные условия биосинтеза, что приводит к снижению уровня накопления любого БАВ, а продукты жизнедеятельности посторонних микроорганизмов могут загрязнять получаемый продукт и снижать его качество. Для обеспечения стерильности процесса вся аппаратура и коммуникации герметизируются, стерилизуются и держатся под давлением. Питательная среда и поступающий на аэрацию воздух стерилизуются. Засев ферментатора и отбор проб из него производят в асептических условиях, то есть в условиях, препятствующих попаданию посторонней микрофлоры.

•Поддержание оптимальной температуры во время процесса

Для биосинтеза каждого живого организма требуется определенная температура. При культивировании грибов оптимальной является температура 22-24°С, тогда как при выращивании актиномицетов обычно поддерживают более высокую температуру - в пределах 2628 °С. При использовании в качестве продуцентов бактерий их выращивание проводят при температуре 35-36 °С. Для культивирования животных клеток необходимо поддерживать температуру строго на уровне 32-37 °С.

Поддержание оптимальной температуры обеспечивается за счет использования теплообменных устройств различной конструкции.

•Соблюдение оптимального значение рН среды и культуральной жидкости в процессе ферментации.

Для биосинтеза большинства известных биообъектов оптимальным уровнем рН является нейтральное значение. При значительном закислении или защелачивании среды и культуральной жидкости процесс биосинтеза биологически активных веществ значительно снижается. Кроме того, многие биологически активные вещества в щелочных или кислых условиях неустойчивы и быстро инактивируются. Изменение рН среды в процессе ферментации зависит в основном от состава питательной среды и характера процесса метаболизма. Клетки животных тканей наиболее чувствительны к рН среды культивирования. Значение рН должно быть обязательно в нейтральной области, и достигается оно за счет того, что в качестве основы питательной среды в этом случае

используют смесь неорганических солей, известную как физиологический солевой раствор (изотонический раствор натрия хлорида).

•Обеспечение культуры достаточным количеством кислорода

Клеточные культуры требуют для роста и развития наличия в среде растворенного кислорода. Во время ферментации происходит одновременно два процесса - растворение кислорода в питательной среде и потребление кислорода живой клеткой.

Продуценты биологически активных веществ используют для дыхания только растворенный в жидкой среде кислород, поэтому обеспеченность живой клетки кислородом определяется скоростью его растворения в культуральной жидкости.

При глубинном культивировании продуцентов БАВ в промышленных масштабах этот процесс осуществляется путем пропускания стерильного воздуха через питательную среду и культуральную жидкость с помощью специальных аэрирующих приспособлений. Воздух при этом, перед попаданием в ферментатор проходит несколько стадий очистки и подается в аппарат стерильным.

•Отсутствие интенсивного вспенивания.

Впроцессе ферментации, при добавлении тех или иных компонентов, а также при перемешивании среды и аэрации возможно образование пены, которая затрудняет процессы дыхания и питания выращиваемых клеток, в связи с чем необходимо предотвращать образование пены.

ПРИЧИНЫ:

1)Наличие в составе питательной среды и культуральной жидкости – белков.

2)Непрерывное пропускание больших объемов воздуха через среду

содновременной работой мешалки

Вспенивание приводит к потере культуральной жидкости из-за уноса с отраб. воздухом и служит причиной контаминации (!)

Для предотвращения пенообразования предусмотрены конструктивные особенности аппаратов или добавление стерильных пенагасителей.

В функцию перемешивающих устройств входит обеспечение отсутствия зон застоя, а также сохранение равномерного температурного поля по всему объему аппарата, своевременный подвод продуктов питания к клеткам и отвод от них продуктов метаболизма.

Чаще всего используют турбулентные мешалки, т.к. жидкости внутри биореактора – вязкие.

При глубинном культивировании, клетки потребляют кислород в растворенном виде.

Обеспечивается это с помощью барбатажа.