ЯГТУ / Профессиональная подготовка специалистов для производства иммунобиологических лекарственных препаратов (вакцин). Направление «Biotechnical» / Теоретические материалы по лекции 2 Промышленное культивирование эукариотических клеточных
.pdfНаучно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России
неподвижным слоем или параллельную ферментацию в роллерных бутылках или клеточных фабриках.
Другим решением может стать культивирование в биоеакторах с неподвижным /
уплотненным слоем
Биореакторы с неподвижным / уплотненным слоем интересны тем, что позволяют получать большие плотности клеток.
Прикрепленные клетки растут на матрице-носителе, а культуральная среда с оптимальными значениями pH и концентрации кислорода, циркулирует через неподвижный слой.
Возможны две схемы реализации процесса:
1.среда циркулирует из емкости для кондиционирования в неподвижный слой и обратно в емкость для кондиционирования (система CellCube на рисунке);
2.неподвижный слой интегрирован в биореактор, и среда, кондиционируемая в этом биореакторе, циркулирует через этот слой.
Есть два основных недостатка таких биореакторов:
1.Ограниченность масштабов.
2.Система является только частично одноразовой: емкость для кондиционирования, датчик концентрации кислорода, а также головка насоса для циркуляции среды используются повторно и требуют подготовки (промывки, очистки, автоклавирования) после каждого производственного цикла. Кроме того, одноразовая и многоразовая части системы должны быть собраны на стенде с ламинарным потоком воздуха.
Рассмотрим несколько примеров. Реактор от NBS был использован для производства первого лицензированного вектора для генной терапии (AdV) в Китае. Затем ATMI коммерциализировала одноразовую реакторную систему с неподвижным слоем (система iCELLis™), которая сопоставима с реакторной системой, разработанной NBS. ATMI предлагает ряд аппаратов с различными объемами, но одинаковой максимальной высотой неподвижного слоя, что означает неизменность процесса при увеличении масштаба производства.
Для успешного проведения процесса культивирования и достижения высокого уровня накопления целевого биотехнологического продукта, необходимо соблюдать ряд важных условий, комплексно влияющих на синтез конечного продукта.
Следует отметить, что животные клетки уступают прокариотическим по продуктивности, а также по достигаемой концентрации конечного продукта в среде. Более того, культивировать животные клетки гораздо труднее, из-за сложного состава среды, механической непрочности животных клеток, а также их свойством расти преимущественно на поверхностях (адгезионно). Поэтому следует уделять особое
Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России
внимание факторам, влияющим на ферментацию клеток млекопитающих. Из них можно выделить: скорость перемешивания (покачивания), объем среды, тип клеток и размер посевного материала, pH, температуру, концентрацию O2 и CO2, окислительновосстановительный потенциал и состав питательной среды (концентрация основных источников питания)
1)Состав среды. В промышленности применяются в основном синтетические среды, в основе которых имеется смесь неорганических солей, главной функцией которых является сохранение pH и осмотического давления среды. Также в состав сред входят сахара (например, глюкоза), витамины, необходимые аминокислоты и другие компоненты. Иногда к синтетическим средам добавляют биологические жидкости, такие как сыворотка или тканевые экстракты, которые обеспечивают клетки гормонами, ростовыми факторами, факторами адгезии, белками, микроэлементами и другим. Наиболее часто добавляемый агентом для культивирования животных клеток является фетальная бычья сыворотка (ФБС).
2)pH для культивирования клеток млекопитающих поддерживают, как правило, на уровне 7,2 – 7,4. Поддержание pH чаще всего обеспечивают с помощью буферных систем (NaHCO3 / HEPES) и поддержанию концентрации CO2, или с помощью добавления в процессе щелочей/кислот.
3)Концентрация CO2, оптимальная для выращивания животных клеток составляет 5- 6%, фактически регулируется содержанием NaHCO3 в питательной среде или HEPES (при этом 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота обладает большей буферной емкостью, чем бикарбонатная система, и обеспечивает стабильный уровень рН среды в диапазоне рН 7,2–7,4 даже в условиях культивирования клеток вне CO2 инкубатора, но данная кислота может негативно влиять на некоторые виды клеток, что необходимо учитывать при использовании определенных культур).
4)Концентрация кислорода чаще всего поддерживается на физиологическом уровне
25-30%.
5)Температура, при которой обеспечивается оптимальный рост культур клеток животных лежит в пределах 36 – 37,5 ͦС.
Общая схема производства аденовирусов включает следующие этапы:
-выращивание клеток до желаемой плотности клеток для заражения;
-заражение определенным количеством аденовирусов при заранее определенной множественности заражения (MOI);
-Завершается процесс выделением вирусного вектора в строго определенное время после инфицирования клеток.
Для промышленного производства отдается преимущество синтетическим средам, которые не содержат продуктов животного происхождения (в таких условиях проще стандартизировать условия проведения процесса). При MOI больше 1 (обычно от 5 до 10)
Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России
происходит заражение всех культивируемых клеток. Температура культивирования поддерживается на уровне 37 градусов Цельсия, оптимальный pH = 7,2 – 7,3 при насыщении кислородом, поддерживаемом на уровне выше 30%.
Следует отметить, что после инфицирования клеток вирусом, замедляется их размножение и рост, однако возрастает потребление глюкозы и кислорода в первые 24 часа после инфицирования (что может быть связано с увеличением энергетических затрат на репликацию вирусов в клетках).
Сборка вирусных частиц и ДНК происходит в промежуток времени от 20 до 48 часов после инфицирования. При этом важно прекратить процесс ферментации до лизиса клеток (иначе процесс очистки будет затруднен). Для оценки этого критерия процесс прекращают при жизнеспособности клеток на уровне 80% - 40%. Временные параметры, а также жизнеспособность клеток сильно зависят от MOI, чем он выше, тем быстрее клетки будут гибнуть и разрушаться.
Максимальный титр вирусных частиц достигается примерно через 40-48 часов после инфицирования (и в это же время начинают гибнуть клетки), при этом максимальная плотность клеток, которую достигали при культивировании - 8*106 кл/мл. Однако с высокими затратами на подкормки или смену питательной среды связано ограничение на плотность клеток примерно в 2*106 кл/мл, при которой прекращают ферментацию. Дальнейшее наращивание биомассы инфицированных клеток экономически нецелесообразно.
Помимо строго соблюдения вышеперечисленных технологических параметров, для получения качественного конечного продукта необходимо использование адекватных аналитических методик для контроля полупродуктов на различных стадий технологического процесса, а также его конечного продукта.
Выбор аналитических методик напрямую зависит от продуцента, используемого при производстве, а также от типа целевого продукта.
Давайте рассмотрим основные контролируемые и анализируемые характеристики полупродуктов и продуктов производства вирусных векторов, а также методы, используемые для их реализации.
Для определения оптимального числа инфицирования ( MOI) клеточной биомассы используют метод проточной цитофлуориметрии. Для этого используют векторные частицы, кодирующие экспрессию зеленого флуоресцирующего белка. Клетки, которые были инфицированы таким вектором начинают экспрессировать трансгенный белок и могут быть легко детектированы по его флуоресценции.
Основная идея проточной цитометрии — «поштучный» анализ клеток в потоке, проходящий с большой скоростью.
Суспензия клеток, помещается в поток жидкости, пропускаемый через проточную ячейку, клетки выстраиваются в цепочку и в таком порядке облучаются лазерным излучением, после чего происходит регистрация сигналов светорассеяния и флуоресценции от каждой клетки.
Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России
Вторым важным показателем, который используют при продукции векторов является титр вирусных частиц. Такая количественная оценка может быть проведена различными методами, давайте рассмотрим основные из них.
И одним из наиболее часто используемых для этих целей методов является – количественная ПЦР. Анализ осуществляется по специфическому гену интереса, присущему анализируемой вирусной частице.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — метод молекулярной биологии, позволяющий создать копии определенного фрагмента ДНК (гена) из исходного образца, повысив его содержание в пробе на несколько порядков, что способствует его детектированию.
Метод количественной ПЦР позволяет не только обнаружить и амплифицировать в пробе целевую нуклеотидную последовательность, но также измерить количество ее копий, и рассчитать количество исходной ДНК. Фиксация накопления продукта происходит в реальном времени с использованием оптических датчиков.
Осуществить количественный подсчет вирусных частиц возможно также с использованием иммуноферментного анализа, основанного на специфическом взаимодействии входящих в аналитическую систему антител к белковым антигенам, находящимся на поверхности анализируемых вирусных частиц, и последующем калориметрическом детектировании сигнала, пропорционального количеству прореагировавших антигенов и антител.
Еще одной классической методикой количественного определения аналитических частиц является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. ВЭЖХ – это аналитический вариант классической колоночной хроматографии высокого давления. ВЭЖХ позволяет проводить одновременное разделение сложных проб на составляющие их компоненты, детектирование большинства компонентов, а также измерение концентрации одного или нескольких соединений. Определение происходит по характерным для конкретных аналитических условий хроматографическим пикам, соответствующим компонентам аналитической смеси.
Пятидесятипроцентная инфекционная доза культуры ткани (TCID 50 ) также является мерой титра инфекционного вируса . Этот анализ конечного разведения определяет количество вируса, необходимое для уничтожения 50% инфицированных клеток хозяев.
Еще одним способом определения титра вирусных частиц является использование технологии поверхностного плазменного резонанса (ПНР).
*Дополнительно ППР представляет собой возбуждение поверхностного слоя (плазмона) на его резонансной
частоте внешней электромагнитной волной в тонком слое проводящего материала, который помещен между двух сред с разными показателями преломления Угол, при котором
Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России
возникает ППР, называется резонансным углом. На поверхности чипа происходит
иммобилизация биологического материала, взаимодействие иммунохимических компонентов реакции с образованием иммунокомплекса. Он в свою очередь изменяет диэлектрические характеристики адсорбционного слоя, что в дальнейшем вызывает изменение резонансного угла, пропорционального концентрации анализируемого соединения.
Загрязнение пробы белками и нуклеиновыми кислотами клеток продуцентов производят методами иммуноферментного анализа а также количественной ПЦР, с которыми мы с Вами уже познакомились.
Кроме того степень чистоы проб могут оценивать методами вертикальногоо электрофореза в полиакриламидном геле и Вестерн блоттинга.
Гель-электрофорез - это метод разделения и анализа макромолекул ( ДНК , РНК и белков ) и их фрагментов в зависимости от их размера и заряда.
Вестерн-блоттинг (иммуноблотинг) —высокочувствительный аналитический метод, используемый для определения в образце специфичных белков с помощью антител. Метод основан на комбинации гель-электрофореза и иммунохимической реакции «антиген/антитело (исследуемый белок)». Высокая степень разрешения достигается за счет электрофоретического разделения белков и специфичности моноили поликлональных антител.
Характеризация вирусных частиц по форме и размеру производится с использованием электронной микроскопии, принцип получения изображения в данном методе основан на пропускании через исследуемый образец пучка электронов.