ЯГТУ / Профессиональная подготовка специалистов для производства иммунобиологических лекарственных препаратов (вакцин). Направление «Biotechnical» / Теоретические материалы по лекции 2 Промышленное культивирование эукариотических клеточных

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

Теоретические материалы для лекции промышленное культивирование эукариотических клеток.

Лектор директор НОЦ МКТ ФГБОУ ВО СПХФУ к.б.н., Янкелевич И.А.

Каждый биотехнологический продукт получают по своей технологии, имеющей отличительные особенности, свои способы организации производства.

Однако, во всех производствах, где в качестве биообъекта используется живая клетка имеются общие типовые стадии.

Любой технологический процесс представляет собой совокупность взаимосвязанных

операций, обеспечивающих переработку исходного материала в продукт.

Биотехнологический процесс отличается наличием биообъекта.

Именно биообъект является определяющим звеном БТ процесса

К основным стадиям биотехнологического производства относят 6 основных операций, которые взаимосвязаны, но отличаются по целям и принципам их достижения:

1.Приготовление и стерилизация питательных сред

2.Получение активного посевного материала

3.Ферментация

4.Выделение и очистка целевого продукта

5.Приготовление товарных форм препарата

6.Обезвреживание и утилизация отходов

Не смотря на общие цели и принципы вышеописанных процессов, в деталях биотехнологический процесс, производимый на разных типах биобъектов будет значительно отличаться.

Поскольку фокус настоящего курса определен производством вакцинных препаратов нам необходимо определиться с итоговым продуктом, производимым в результате биопроцесса, а также с биообъектом – продуцентом, с использованием которого его производят.

Первоначальный смысл понятия вакцина заключен в следующем определении.

Вакцинами называют препараты, предназначенные для формирования иммунологической памяти и протективного иммунитета к антигенам возбудителей, минуя стадию инфекционного заболевания.

Вакцинацией называют способ создания протективного иммунитета с помощью вакцин.

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

Расширенное употребление термина вакцины (в отношении препаратов с противоопухолевой, противоаллергической активностью или направленных на лечение аутоиммунных заболеваний) заставляет несколько изменить акценты.

Вэтом, новом смысле под вакцинами следует понимать препараты, содержащие

антигенный материал, направленные на предотвращение и лечение инфекционных, опухолевых процессов, а также проявлений гиперчувствительности путем индукции эффекторных клеток и клеток памяти, оказывающих защитное действие.

Вэтом разделе речь пойдет в основном о противоинфекционных вакцинах.

Внастоящее время выделяют 4 поколения вакцин, подразделенных на классы - которые отличаются по способу получения, эффективности, частоте возникновения побочных реакций и другим параметрам.

К препаратам первого поколения относятся вакцины, основу которых составляют живые ослабленные или убитые (инактивированные) вакцины. Это корпускулярные вакцины. Препаратами второго поколения являются вакцины, состоящие из отдельных фракций возбудителей или их продуктов. К ним относятся

- сплит-вакцины -субъединичные вакцины -анатоксины -конъюгированные вакцины

Третье поколение препаратов составляют рекомбинантные и векторные вакцины.

Наконец, к вакцинам четвертого поколения, ещё не внедренным в практику здравоохранения, относятся :

-петидные -антиидиотипические вакцины, -ДНК вакцины,

-вакцины, содержащие продукты генов главного комплекса гистосовместимости

-вакцины полученные на трансгенных растениях

Давайте подробнее остановимся на вакцинах третьего поколения -векторных вакцинах.

В результате последних достижений в области молекулярной биологии и генной инженерии стало возможным создавать живые рекомбинантные векторы, способные доставлять гетерологичные антигены путем введения генов, кодирующих антиген. Идея этого подхода заключается в использовании способности к инфицированию и иммунологических свойств живого вектора для того, чтобы вызвать иммунный ответ против его собственных белков, а также в отношении представленного гетерологичного белка.

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

Ретровирус представляет собой оболочечный одноцепочечный РНК-вирус, содержащий обратную транскриптазу. Ретровирусные векторы обычно являются дефектными по репликации, и большинство из них имеют мышиное или птичье происхождение. Наиболее широко из них исследован вирус лейкемии мышей Молони (MoMLV). Ретровирусы требуют интеграции генома для экспрессии генов. Таким образом, ретровирусные векторы, обеспечивают долговременную экспрессию генов. Размер генома составляет приблизительно 7–11 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н), и вектор может легко содержать вставки чужеродной ДНК длиной 7–8 тысяч пар нуклеотидов. Ретровирусы обладают низкой иммуногенностью, и у большинства пациентов не обнаруживается ранее существовавший иммунитет к ретровирусным векторам. Однако ретровирусы связаны с различными заболеваниями. Например, вирус лейкемии мышей Молони вызывает лейкемию и лимфому, хотя и является видоспецифичным.

Лентивирусы составляют подкласс ретровирусов. Лентивирусы инфицируют как неделящиеся, так и делящиеся клетки, тогда как ретровирусы инфицируют только делящиеся клетки. Таким образом, лентивирусы обычно демонстрируют более широкий тропизм, чем ретровирусы. Некоторые белки, такие как tat и rev, регулируют репликацию лентивирусов. Эти регуляторные белки отсутствуют у ретровирусов. Хотя лентивирусы потенциально могут запускать онкогенез, риск ниже, чем у ретровирусных векторов, поскольку сайты интеграции лентивирусов находятся далеко от сайтов, несущих клеточные промоторы. Остальные преимущества лентивирусных векторов аналогичны преимуществам ретровирусных векторов. На основе ВИЧ являющегося хорошо известным лентивирусом, был создан вектор доставки трансгена.

Аденоассоциированный вирус – это небольшой вирус с одноцепочечной ДНК, у которого отсутствует оболочка. На его основе был создан непатогенный вирусный вектор; вирус имеет низкую иммуногенность и никогда не проявлял патогенности. Геном аденоассоциированного вируса интегрируется в геном человека в определенном участке хромосомы. Векторы на основе аденоассоциированного вируса обеспечивают долговременную экспрессию трансгена. Вирус может инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки и имеет широкий тропизм для многих различных типов клеток.

Было обнаружено двенадцать серотипов аденоассоциированного вируса у людей и более 100 серотипов аденоассоциированного вируса у различных видов животных, включая нечеловеческих приматов, собак и птиц. \

Каждый серотип имеет уникальные рецепторы, а тканевая специфичность определяется серотипом капсида.

Обычно рекомбинантные векторы Аденоассоциированного вируса получают путем делеции кодирующих областей Rep и Cap между инвертированными концевыми повторами. Эти области используются для экспрессии эндогенного трансгена. Из-за делеции этих областей векторы Аденоассоциированного вируса не могут интегрироваться в геном хозяина, и их ДНК сохраняется в эписомальной форме. Эта предпочтительная особенность векторов Аденоассоциированного вируса повышает их профиль безопасности путем предотвращения начала онкогенеза. Вектор Аденоассоциированного вируса имеет трансгенную емкость приблизительно 4,5 т.п.н., что ниже, чем у других вирусных векторов, включая вирус герпеса (30 т.п.н.), аденовирус (8–10 т.п.н.) и ретровирус (7-8 т.п.н.).

Другим перспективным вирусом является Цитомегаловирус. Цитомегаловирус (ЦМВ) является членом герпесвирусов. Выявлено несколько видоспецифичных

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

Цитомегаловирусов. Среди них наиболее тщательно изучен Цитомегаловирус человека (HCMV), также известный как вирус герпеса человека 5 типа. Цитомегаловирус человека содержит геном двухцепочечной линейной ДНК длиной 235 т.п.н., окруженный капсидом. Оболочка содержит гликопротеины gB и gH, которые связываются с клеточными рецепторами. Цитомегаловирус часто остается незамеченным, потому что его патогенность у иммунологически здоровых людей легкая. Патогенез представляет опасность только у беременных женщин и лиц с ослабленным иммунитетом.

Аденовирусы представляют собой семейство ДНК-содержащих вирусов позвоночных, не имеющих липопротеиновой оболочки обычно вызывающие легкие инфекции верхних или нижних дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта или конъюнктивы

Геном аденовируса кодирует примерно 35 белков, которые экспрессируются в двух основных фазах: «ранняя», которая происходит примерно через 7 часов после заражения, то есть до инициации репликации вирусной ДНК, и «поздняя», которая происходит после инициации репликации ДНК.

Примерно 20 ранних белков обладают регуляторными функциями, которые позволяют вирусу контролировать клетку и осуществлять репликацию вирусной ДНК. Поздние гены

– это в основном структурные белки вируса. Вирионы собираются в ядре, начиная примерно через 1 день после заражения, и через несколько дней клетка лизируется с выделением инфекционного вируса. Около 10 000 вирионов потомства продуцируются в пермиссивных клетках.

Человеческие аденовирусы повсеместно распространены, и большинство людей инфицировано одним или несколькими серотипами, что приводит к пожизненному иммунитету. Инфекция может протекать бессимптомно или приводить к заболеванию, которое обычно протекает в легкой форме у иммунокомпетентных людей.

Всего существует по меньшей мере 57 серотипов человеческих аденовирусов, которые образуют семь «видов» A – G. Все серотипы похожи по общей структуре и функциям большинства белков, но определенные уникальные функции белков вносят вклад в уникальные свойства серотипа и вида.

В то время как большинство аденовирусных инфекций протекают в легкой форме, аденовирус может быть опасным для людей с ослабленным иммунитетом, особенно у пациентов с трансплантатами, у которых аденовирус, вероятно, реактивируется в результате латентных или устойчивых инфекций низкой степени тяжести. Например, у пациентов с трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток заболеваемость аденовирусами колеблется от 3% до 47%. При трансплантации аллогенных стволовых клеток заболеваемость составляет от 9% до 14% среди взрослых и от 20% до 47% среди детей. У пациентов с трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток аденовирусы могут вызывать респираторные заболевания, колит, гепатит, геморрагический цистит, кератоконъюнктивит и диссеминированные инфекции. Диссеминированные инфекции и, как правило, летальность могут возникать у пациентов с тяжелой лимфопенией (менее 300 клеток / мкл).

С человеческими векторами аденовируса было или проводится более 400 испытаний генной терапии, большинство из которых предназначены для лечения рака, но некоторые из них предназначены для использования векторов аденовируса в качестве вакцин, в которых вектор экспрессирует чужеродный антигенный белок. Кроме того, миллионы

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

призывников ранее были успешно иммунизированы против острых респираторных заболеваний путем введения в желудочно-кишечный тракт живых вакцин аденовируса серотипов 4,7 в форме капсул с энтеросолюбильным покрытием.

Аденовирусные векторы имеют множество преимуществ так, например, аденовирусные векторы хорошо изучены, аденовирусные векторы можно выращивать в стабильные запасы с высоким титром, они инфицируют неделящиеся и делящиеся клетки разных типов и сохраняются в клетках как эписомы, почти все клинические испытания показали, что аденовирусные векторы безопасны и хорошо переносятся.

Из всех существующих подтипов человеческого аденовируса, аденовирус серотипа 5 является наиболее охарактеризованным и наиболее часто используется в испытаниях вакцин. Аденовирус серотипа 5 - это стабильный нереплицирующийся вирус, характеристики которого способствуют его безопасному применению. Этот вирус позволяет встраивать в свой геном большие сегменты чужеродной ДНК (около 8 т.п.н.), и, кроме того, он может быть получен с высокими титрами и легко очищен.

Стоит так же отметить, что применение генно-инженерных вакцин на основе аденовируса серотипа 5 может быть ограничено наличием предсуществующего иммунного ответа у людей, уже встречавшихся ранее с этим вирусом (а это достаточно большая часть популяции людей – в зависимости от региона варьирующаяся от 45 до 90%)

Так как большинство людей подвергались воздействию аденовируса, наличие ранее существовавшего иммунитета против аденовируса является недостатком вектора. Для решения данной проблемы поступают следующим образом аденовирус содержит три основных структурных белка: гексон, пентон и волоконный белок. Эти белки являются основными мишенями гуморального и клеточного иммунного ответа против аденовируса серотипа 5. Антитела против гипервариабельных участков (HVR) гексонового белка доминируют в нейтрализующих ответах. Модификация этих гипервариабельных участков и домена волоконных выступов была исследована как способ избежать ранее существовавшего иммунитета.

Другая проблема использования аденовекторов заключается в том, что, хотя дефектная репликация и снижает общую вирулентность аденовируса, всё же требуется дальнейшее улучшение клинического профиля безопасности аденовирусных-векторов. Например, поскольку, аденовирусная инфекция инициируется распознаванием рецептора вируса Коксаки-аденовируса (CAR), на клетках-мишенях карбокси-концевой частью (то есть выступом) белка волокна, а рецептор Коксаки-аденовируса (CAR) экспрессируется на высоком уровне в гепатоцитах, векторы на основе аденовируса серотипа 5 обладают сильным тропизмом к паренхиматозным клеткам печени, что увеличивает гепатотоксичность. Модификация волоконного белка аденовируса может изменить его тропизм и снизить токсичность для печени. Другой подход - модуляция иммунного ответа хозяина за счет снижения экспрессии вирусных генов. Делеция участков вирусных генов E2 и E4 снижает токсичность за счет снижения иммунного ответа, вызванного вектором, в инфицированных клетках. Этот вектор называется вектором аденовируса 2-го поколения.

Как уже было сказано ранее, аденовирусная инфекция инициируется распознаванием нативного рецептора аденовируса серотипа 5, рецептора вируса Коксаки-аденовируса (CAR), на клетках-мишенях. Следовательно, эффективность заражения аденовирусом очень низкая для клеток с низким содержанием данных рецепторов или без них вовсе. Для

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

решения этой проблемы было использовано введение мотива Arg-Gly-Asp (RGD) в открытые на поверхности петли выступа аденовирусного волокна, позволило аденовирусу обходить рецепторы вируса Коксаки-аденовируса и опосредовать вход в клетку через интегрины, связывающие упомянутый ранее мотив. Таким образом, модифицированный данным образом аденовирус можно использовать для «перенацеливания» на клетки, в которых обычный аденовирус не работает. Инфекционная эффективность модифицированного таким образом аденовируса, в некоторых клетках, включая макрофаги человека или мыши, Т-клетки, синовиоциты, островковые трансплантаты, адипоциты, и других. может быть в десятки или сотни раз выше, чем у стандартного аденовируса серотипа 5

Большинство аденовирусных-векторов являются генетически модифицированными версиями аденовируса пятого серотипа, и они бывают двух типов: репликационнодефектные (RD) и репликационно-компетентные (RC). Репликационно-дефектные векторы в свою очередь подразделяются на хелпер-зависимые и хелпер независимые.

Рассмотрим в начале хелпер независимые. В репликационно-дефектных хелпер независимых векторах важные гены E1A и E1B, удалены и заменены кассетой экспрессии с промотором высокой активности, таким как промотор раннего цитомегаловируса (CMV), который управляет экспрессией чужеродного трансгена.

Ген E1A кодирует непосредственно ранние белки, необходимы для репликации аденовируса индуцирующие экспрессию около 20 отложенных ранних генов в единицах транскрипции E1B, E2, E3 и E4, и они изменяют экспрессию множества клеточных генов, чтобы облегчить репликацию аденовируса.

Ген E1B кодирует белки в целом ингибируют апоптотический ответ клетки-хозяина на инфекцию аденовируса. В большинстве векторов аденовируса отсутствуют гены E3, которые в целом предотвращают уничтожение инфицированных клеток иммунной системой и не являются необходимыми для репликации аденовируса в культуре клеток или in vivo.

Данные векторы с делецией E1A и E1B обычно конструируют из плазмид или ДНК, содержащих генетически модифицированный геном аденовируса, векторы выращивают на комплементарных клеточных линиях, таких как HEK293, PER.C6 или N52.E6, которые сохраняют и экспрессируют E1A и гены E1B

Другой тип репликационно-дефектных векторов – это «хелпер-зависимые» (HDAd) векторы, в которых большая часть генома удалена, но сохранены точки начала репликации ДНК на каждом конце генома, а также около 500 пар оснований на левом конце генома, необходимые для упаковки генома в вирионы. Данные векторы могут иметь высокую способность к клонированию (около 37 пар килобаз (Напомню 1 килобаза соответствует 1000 пар оснований ДНК или РНК)) и, как таковые, могут удерживать несколько трансгенов.

Хелпер-зависимые репликационно-дефектные векторы конструируются и размножаются в присутствии репликационно-компетентного помощника, который обеспечивает необходимые ранние и поздние белки, необходимые для репликации. Обычно помощник аденовирус имеет сайты loxP, фланкирующие сигнал упаковки в геноме. Клеточные линии, используемые для получения хелпер-зависимых репликационно-дефектных

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

векторов, условно экспрессируют рекомбиназу Cre, которая вырезает сигнал упаковки, фланкированный loxP, из вспомогательного генома аденовируса, тем самым обеспечивая предпочтительную упаковку генома хелпер-зависимого репликационно-дефектного вектора (в котором отсутствуют сайты loxP). Хелпер-зависимые репликационнодефектные векторы отделяется от помощника путем ультрацентрифугирования на градиентах плотности хлорида цезия. Требуется несколько раундов очистки. Для крупномасштабных целей репликационно-дефектные векторы и вспомогательный аденовирус разделяют с помощью анионообменной и эксклюзионной хроматографии.

Репликационно-дефектные векторы аденовируса широко применяются в качестве вакцин, поскольку они индуцируют сильный гуморальный и особенно сильный Т-клеточный ответ, имеющий тенденцию к ответу типа Т-хелперов 1, на трансген, экспрессируемый вектором.

*Дополнительно

Самым заметным исследованием было так называемое исследование STEP, которое проводилось с использованием смеси трех репликационно-дефектных векторов на основе аденовируса пятого серотипа, экспрессирующих несколько белков вируса иммунодефицита человека, в качестве вакцины против ВИЧ. Эта вакцина, произведенная компанией Merck, была использована примерно у 3000 добровольцев во многих странах, начиная с 2004 года. Вакцина хорошо переносилась, несмотря на многократные

внутримышечные инъекции до 10 11вп за инъекцию. Это испытание STEP было остановлено в 2007 году из-за неожиданного открытия, что добровольцы, которые были вакцинированы, имели более высокий уровень заражения ВИЧ, чем те, кто получал плацебо.

В качестве примера успешного применения аденовирусных векторов для создания вакцины можно привести создание отечественной вакцины от геморрагической лихорадки Эбола. Так вакцина ГамЭвак состоящая из живого аттенуированного рекомбинантного вируса везикулярного стоматита и аденовируса серотипа-5, экспрессирующих гликопротеин оболочки вируса Эбола смогла вызвать образование гуморального и клеточного иммунного ответа против вируса Эбола

Таким образом, в зависимости от особенностей строения получаемого вектора и способа его полученияможно выделить две основные линии технологического процесса при в производстве аденовирусных векторов:

Первая из которых предполагает использование хелперных вирусов или плазмид

Второе – на основе стабильной производственной линии

Самая распространенная и наиболее документированная упаковывающая клеточная линия для аденовирусных векторов - это культура почек эмбриона человека HEK293, которая содержит область E1 аденовируса . Упаковка клеток на основе клеточной линии 293 является универсальной, и их можно выращивать в виде адгезионных или суспензионных культур в различных вариациях питательной среды.

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

Теперь, когда мы сфокусировали наше внимание на конкретном виде биологического объекта – клеточной культуре, а также на продукте – вирусном векторе -

вернемся далее к рассмотрению промышленной организации биотехнологического процесса.

Начинается БТ процесс, с предферментационных стадий – приготовления и стерилизации ПС, выращивания посевного материала, среди вспомогательных стадий можно выделить подготовку воздуха и воды.

Главной и основной стадией любого биотехнологического процесса является ферментация, именно на этой стадии получают целевой продукт.

Последующие за ней стадии будут направлены на выделение и очистку целевого продукта

– этой теме будет посвящена Ваша следующая лекция.

Завершается технологический процесс фасовкой и упаковкой готового продукта.

На второй части лекции мы сфокусируемся свами на пред-ферментационных этапах и непосредственно самой ферментации.

Ферментация – главная продуктивная стадия БТ процесса, т.к. на ней образуется целевой продукт.

Под ферментацией понимают любой процесс выращивания биологического объекта в питательной среде в определенных условиях в результате которого образуется биотехнологический продукт.

Для максимального синтеза целевого продукта, помимо подбора оптимальных условий самой ферментации, необходимо также обеспечения оптимального прохождения предварительных этапов подготовки.

Условия максимального синтеза биотехнологического продукта:

Приготовление качественной и стерильной питательной среды

Приготовление активного посевного материала

Проведение процесса в специальных биореакторах – ферментаторах

Поддержание стерильности (соблюдение асептичных условий) – отсутствие посторонних микроорганизмов в процессе ферментации

Поддержание оптимальной t°

Поддержание оптимального PH

Обеспечение культуры продуцента необходимым газообменом (кислород, углекислый газ, если необходимо)

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

Давайте подробнее познакомимся с этапом стериллизации:

Стерилизация.

Клетки животных очень чувствительны даже к малейшим изменениям условий культивирования и совсем не переносят контаминации любыми микроорганизмами. Поэтому культивирование клеток животных должно производиться в строго асептических условиях, иначе неизбежны большие потери реактивов, самих клеток и продукта.

Одним из условий асептической работы является стерилизация оборудования, в котором проходит культивирование, инструментов, питательных сред и добавок.

Определение стерилизации из Фармакопеи:

Стерилизация – это валидируемый процесс, используемый при получении стерильных лекарственных форм для освобождения продукта, оборудования, вспомогательных веществ и упаковки от живых микроорганизмов и их спор.

По типу стерилизующего агента различают физическую и химическую стерилизацию, а также стерилизующую фильтрацию.

Физическая стерилизация подразделяется на стерилизацию ультафиолетовым и ионизирующим излучениями, термические методы стерилизации.

Для стерилизации ультрафиолетом более правильно использовать термин обеззараживание ультрафиолетом. Ультрафиолетовые лампы используются для обеззараживания воды, воздуха и различных поверхностей во всех сферах жизнедеятельности человека. Полной стерилизации от микроорганизмов при помощи УФизлучения добиться невозможно — оно не действует на некоторые бактерии, многие виды грибов и прионы. А также стерилизующая способность УФ-излучения ограничена его проникающей способностью. Данный способ не описан в Фармакопее.

Радиационный метод стерилизации осуществляют путем облучения продукта ионизирующим излучением. Данный метод может быть использован для стерилизации лекарственного растительного сырья, лекарственных растительных препаратов, лекарственных средств растительного происхождения и др. Преимуществом радиационной стерилизации является ее низкая химическая активность и легко контролируемая доза излучения, которая может быть точно измерена. Радиационная стерилизация проходит при минимальной температуре, однако могут быть ограничения при использовании некоторых типов стеклянной и пластиковой упаковки.