ЯГТУ / Профессиональная подготовка специалистов для производства иммунобиологических лекарственных препаратов (вакцин). Направление «Biotechnical» / Презентация лекции 3 Выделение и очистка биологически активных субстанций
.pdf
Хроматография |
41 |
Объект выделения – Изоэлектрическая точка
Среднее значение изоэлектрической точки белков человека 6.81
Virtual 2D-PAGE plot for 92,179 proteins (isoelectric point calculated http://isoelectricpointdb.org/
Хроматография |
42 |
Классификация методов на основе свойств компонентов смеси
Свойство белковой молекулы |
Тип хроматографии |
|
|
Специфический сайт |
Аффинная (AC) |
взаимодействия |
|
|
|
Сайт связывания ионов металлов |
Металл-аффинная (IMAC) |
|
|
Заряд |
Ионообменная (IEX) |
|
|
Изоэлектрическая точка |
Хроматофокусировка (CF) |
|
|
Размер |
Гель-фильтрация (GF, SEC) |
|
|
Гидрофобность/ гидрофильность |
Гидрофобная (HIC) |
|
Обращеннофазная (RPC) |
|
|
Хроматография |
43 |
Аффинная (AC)
•Метод основан на обратимом взаимодействии целевого белка
(или комплекса) с лигандом, иммобилизированнымна
поверхности сорбента
•Взаимодействие может быть «биоспецифичным» (типа белок А –антитело) или «небиоспецифичным(типа Ni 2+ -His-tag)
•Типичная схема включает классические этапы: нанесение
образца / связывание, отмывка, элюирование, регенерация
•Элюирование может осуществляться с помощью
конкурентного лигандаили изменения свойств буфера
Хроматография |
44 |
Аффинная (AC)
Основные характеристики:
•Как правило является первой стадией при очистке (Capture step) в случае, если целевой белок
имеет специфические аффинные группы
•Возможна одностадийная очистка
•Высокая емкость, специфичность, разрешение, скорость
•При очистке происходит концентрирование образца
•Возможно элюирование в «мягких» условиях, оказывающих минимальное влияние на
активность белка.
Хроматография |
45 |
Металл-аффинная (MAC)
•Частный случай AC –основан на обратимом взаимодействии белков с гистидиновым тагом с бивалентными ионами металлов (Ni, Co, Zn, Cu)
•Связывание и элюирование(ступенчатое или градиентное) осуществляется с помощью изменения концентрации имидазола
•Метод может быть использован даже для неочищенного лизата
Хроматография |
46 |
Аффинная (AC)
Поисковой протокол – градиент для поиска оптимальной концентрации элюэнта
Производственный протокол –применение подобранной концентрации для элюции в оптимальном объеме
Хроматография |
47 |
Аффинная (AC)
Идеальный вариант развития событий
Хроматография |
48 |
Гель-фильтрация (GF, SEC)
•Метод основан на использовании сорбентов с
определенной пористостью
•Разделение происходит на основании размера молекул –скорости их прохождения через слой
сорбента
•Разделяемые молекулы не связываются с сорбентом
•Элюирование изократическое, может проводиться в
широком диапазоне условий
•Состав буфера, как правило, не влияет на
разрешение разделения
•При очистке происходит разбавление образца
Хроматография |
49 |
Гель-фильтрация (GF, SEC)
Хроматография |
50 |
Гель-фильтрация (GF, SEC)
Пример группового разделения – рекомбинантного 6his-белка
Пример хроматограммы при разделении смеси белков по молекулярной массе