ЯГТУ / Профессиональная подготовка специалистов для производства иммунобиологических лекарственных препаратов (вакцин). Направление «Biotechnical» / Лекция №1. Эукариотические клеточные культуры и методы работы с ними

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

возможности заражения воздушно-капельным путем персонала и контаминации воздуха рабочего помещения и окружающей среды;

минимизации риска заражения и перекрестной контаминации продукта;

возможности работы с небольшим количеством токсичных химических веществ, радионуклидов и удалении запахов рабочих агентов при обязательном подключении

бокса к индивидуальной системе активной вытяжной вентиляции;

При этом, бокс микробиологической безопасности II класса не обеспечивает защиту от токсичных химических веществ и радионуклидов, а также не удерживает запахи рабочих агентов.

Инвертированный микроскоп (слайд 22)

Инвертированный микроскоп является одним из самых важных инструментов в лаборатории клеточных культур, с помощью которого можно микроскопировать клетки прямо в культуральной ёмкости без приготовления цитологических препаратов (мазков клеток), что позволяет легко и быстро получить сведения о морфологии культивируемых клеток, фазе роста культуры и степени конфлюентности монослоя.

Какую бы процедуру ни производили над клетками, чрезвычайно важно тщательно исследовать культуру для подтверждения отсутствия признаков заражения. С помощью инвертированного микроскопа легко распознаются черты микробиологической контаминации. Помимо этого, клетки должны проверяться на наличие признаков ухудшения их состояния, таких как грануляция вокруг ядра, вакуолизация цитоплазмы, приобретение клетками округлой формы с отделением их от субстрата. Такие признаки могут означать, что культура требует замены среды, либо может означать наличие более серьезной проблемы, например неадекватности или токсичности среды или сыворотки, истощения или старения клеточной линии.

Возможность микроскопирования клеток в культуральной посуде обусловлена тем, что оптическая система инвертированного микроскопа «перевернута» – объектив находится под предметным столиком, т.е. под исследуемым образцом, а осветительный конденсор – сверху. При этом, инвертированные микроскопы отличаются меньшим увеличением (как правило, не более 40Х) по сравнению с другими микроскопами из-за увеличенной толщины стенок культуральной посуды, однако этого увеличения вполне достаточно для рутинного контроля состояния клеточных культур.

Использование инвертированного микроскопа с фазово-контрастной оптикой позволяет видеть живые неокрашенные клетки с более высокой контрастностью, чем при обычном освещении.

Инвертированный микроскоп с возможностью флуоресцентной микроскопии позволяет с высокой степенью контрастности визуализировать различные структуры клеток (ядра мертвых и живых клеток, митохондрии, цитоскелет, цитоплазматическую мембрану и т.д.) наблюдать за клеточными процессами в динамике (пролиферация, апоптоз, клеточный цикл, метаболизм и т.д.), исследовать локализацию целевой молекулы в клетке и многое другое.

Кроме того, инвертированные микроскопы могут быть дополнены или изначально сконструированы с дисплеем, на который выводится изображение клеток, что очень удобно.

Дозирующие устройства и материалы (слайд 23)

Простое дозирование (перенос жидкости из одной емкости в другую) является одной из наиболее частых повседневных манипуляций с культурами клеток.

Для дозирования больших объемов жидкостей, например, при субкультивировании или смене питательной среды, используют стерильные пластиковые одноразовые серологические пипетки в широком ассортименте объемов (1 мл, 2 мл, 5 мл, 10 мл, 25 мл, 50 мл), в которые жидкость набирается с помощью автоматических дозаторов для серологических пипеток, снабженных фильтрами для защиты от попадания внутрь случайно забранных жидкостей. Для дозирования маленьких объемов жидкостей, например, при подсчете клеток или микротитровании в лунки многолуночного планшета, используют механические (реже – автоматические) одноканальные и многоканальные дозаторы с регулируемым объёмом от 0,1 мкл до 10 мл, для которых требуются соответствующие стерильные пластиковые одноразовые наконечники. Наконечники можно покупать россыпью в больших упаковках, с тем чтобы

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

упаковывать и стерилизовать их в условиях лаборатории. Их можно также покупать уже стерильными и готовыми к использованию. Предварительно упакованные наконечники намного удобнее, но значительно дороже.

Если вы используете достаточно маленькие контейнеры (например, микроцентрифужные пробирки), то можно избежать прикосновения нестерильных частей корпуса дозатора, поэтому его использование допустимо при условии, что наконечник снабжен фильтром, препятствующим перекрестному заражению и минимизирующим контаминацию. В противном случае вы рискуете получить микробное загрязнение от нестерильных частей дозатора или, что более значимо, перекрестное заражение из аэрозоля и жидкости, попавших внутрь этого дозатора.

Обычное субкультивирование, которое должно быть быстрым, точным и с высокой степенью защиты от загрязнения и перекрестной контаминации, следует проводить с использованием серологических пипеток и дозатора для серологических пипеток. Экспериментальная работа, которая должна быть точной, но не требует длительного размножения используемых клеток, позволяет использовать дозаторы маленького объема.

Оборудование для подсчета клеток (слайд 25)

Подсчет клеток, необходимый при каждом субкультивировании и подготовке клеток к опыту, можно осуществлять двумя способами:

1)вручную с помощью гемоцитометра (внешне одинаковы – толстое предметное стекло с углублениями с покровным стеклом, но принципиально отличаются между собой сеткой, нанесенной на предметное стекло, в которой считают клетки) и прямого светового микроскопа;

2)на автоматическом счетчике клеток.

Ручной подсчет клеток подразумевает подготовку гемоцитометра (притирание

покровного стекла к предметному до образования колец Ньютона, что не так просто и может занимать достаточное количество времени, что при большом потоке неудобно), нанесения заранее подготовленной аликвоты клеток в образованную между предметным и покровным стеклом ячейку, а затем подсчет клеток под световым микроскопом в квадратах сетки (в соответствии с используемой в лаборатории методикой, которая может варьироваться в зависимости от размеров клеток, например, подсчет клеток в двадцати больших квадратах по диагонали), при этом не забывая про правило Егорова. Затем, полученное значение количества клеток в квадратах сетки переводится в концентрацию клеток по формуле, которая также может варьироваться от лаборатории к лаборатории.

Обычно для оценки здоровья культуры подсчитывают количество как живых, так и мертвых клеток. Для учета мертвых клеток к анализируемой клеточной суспензии добавляют трипановый синий, который способен проникать в цитозоль мертвых клеток, поскольку целостность их цитоплазматической мембраны нарушена, что не характерно для живых клеток. Однако, он токсичен для клеток, и поэтому подсчет клеток ограничен по времени в пять минут. Чем дольше на клетки воздействует трипановый синий, тем больше вероятность получить результат, неадекватно отображающий состояние клеток в культуре. Это обстоятельство значительно усложняет процесс ручного подсчета клеток для сотрудников лаборатории клеточных культур, не имеющих опыта работы с гемоцитометром, но не затрудняет процесс для опытных операторов.

Автоматический подсчет клеток выполняется с помощью специального оборудования – счетчиков клеток. На рынке представлен большой ассортимент самых разных по сложности моделей, среди которых для рутинных исследований широко распространен счетчик TC20 компании Bio-Rad. Важным расходным материалом для работы с автоматическими счетчиками клеток являются одноразовые пластиковые слайды, очень похожие на обычные гемоцитометры, однако не требующие никакой подготовки. Анализируемую пробу просто нужно внести в ячейку слайда, вставить слайд в счетчик, который автоматически начнет подсчет клеток, и оценить полученные результаты, выводимые на дисплей. Преимуществами автоматического счетчика клеток являются простота и быстрота получения результатов, а недостатками – зависимость точности подсчета клеток от их концентрации в анализируемом образце (если концентрация

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

клеток не попадает в ограниченный для каждого счетчика диапазон значений, точность подсчета падает), а также дороговизна одноразовых слайдов, цена которых, в среднем, составляет около ста рублей за один слайд (один слайд – два исследования).

Техника асептической работы (слайд 26)

Техника асептической работы имеет целью исключить заражение путем установления жестких норм, правил и гарантий того, что каждый сотрудник, использующий оборудование, придерживается их.

Суть правил асептической работы с культурами клеток во многом основывается на принципах надлежащей лабораторной практики (GLP). Поверхность рабочего места должна быть ровной и чистой, на ней должны находиться лишь те предметы, которые вам необходимы для работы в настоящее время. Приготовьте заранее то, что вам может понадобиться, так чтобы культуры вынимались из инкубатора на менее продолжительный срок, все манипуляции должны производиться так быстро, как это возможно, без препятствий и помех. Предметы на столе должны располагаться в зоне прямой видимости. Избегайте случайного контакта стерильных и нестерильных поверхностей. После работы оставляйте рабочее место чистым.

Хотя лабораторные условия в настоящее время в большой мере облегчают соблюдение асептики (кондиционирование и фильтрация воздуха, УФ-рециркуляторы, боксы микробиологической безопасности и т.д.), современные лаборатории нередко переполнены персоналом, и оборудование часто используется несколькими людьми. Тем не менее при жестком соблюдении мер предосторожности не трудно соблюдать стерильность.

Количество оборудования в помещениях культуральной лаборатории зависит от количества работающих людей, от того, сколько времени они будут работать еженедельно и какой тип культуры они будут вести. С учетом этих вопросов следует решать, сколько боксов микробиологической безопасности потребуется (с учетом того, смогут ли работники использовать бокс совместно или каждый из них занимает бокс в течение всего рабочего дня), и необходимо ли обеспечить большое пространство для манипуляций с биореактором, работой с животными тканями и большим количеством различных линий клеток. Ориентировочно, при работе лаборатории, состоящей из 50 человек, выполняющих различную работу, требуется 12 боксов микробиологической безопасности (при их совместном использовании).

Следует учитывать, что пространство между ламинарными шкафами должно составлять не менее 500 мм для обеспечения свободного доступа к ним и снижения до минимума возможности смешения воздушных потоков. В это пространство можно поместить инкубатор, передвижную тележку или столик на колесиках, на которых могут располагаться бутыли, флаконы, реактивы, а также лабораторные журналы.

Зонирование лаборатории клеточных культур (слайд 27)

С появлением и внедрением боксов микробиологической безопасности позволило работать с культурами клеток в неспециализированных помещениях при условии, что размещение оборудования соответствует имеющимся требованиям. Это экономически более выгодно, чем создание чистых зон и изолированных комнат с одном только боксом микробиологической безопасности. Однако, отдельное помещение обеспечивает лучшую защиту от заражения.

Помещение лаборатории клеточных культур должно быть зонировано таким образом, чтобы наиболее грязные работы осуществлялись ближе к входной двери, а асептическая зона – в самом дальнем конце комнаты, наиболее отдаленном от дверей. При этом не допускаются перекрестные потоки материалов, клеточных линий, а также частое движение, активное общение и пение. Кроме того, перед входом в лабораторию клеточных культур необходимо надевать сменную обувь с закрытым носком, халат с длинными рукавами, а волосы забирать назад или надевать шапочку.

Правила асептической работы в боксе (слайд 28)

Очень важно содержать рабочую поверхность бокса микробиологической безопасности свободной и чистой. Следует соблюдать следующие правила:

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

1)начинайте работу только на совершенно чистой поверхности и после обработки воздуха и внутренних поверхностей бокса УФ-облучением в течение, как минимум, 15 минут. Эффективность ультрафиолетовой обработки несомненна, поскольку свет проникает в щели, куда не может проникнуть этанол или другие дезинфицирующие агенты;

2)после обработки УФ обязательно протирайте поверхности камеры бокса безворсовой салфеткой и 70%-м раствором этанола;

3)загружайте в рабочую камеру бокса только те предметы, которые вам потребуются для планируемой работы; убирайте все, что вам не нужно, протирая поверхность между манипуляциями;

4)организуйте ваше рабочее место так, чтобы вы имели свободный доступ ко всем предметам и не тянулись через одни, чтобы достать другие; а также чтобы вы имели для работы большое свободное пространство в центре стола (не только в передней его части). Если вокруг вас будет слишком много оборудования и материалов, возрастет риск контакта наконечника или кончика стерильной пипетки с нестерильной поверхностью. Более того, ламинарный поток в боксе, заставленном посудой и оборудованием, резко нарушается, в т.ч. вследствие перекрытия перфорации, через которой циркулирует воздух;

5)организуйте работу так, чтобы все необходимые вам предметы (серологические пипетки, наконечники, дозаторы, емкость для слива, культуральные реактивы и др.) находились в поле вашего зрения и не закрывались вашими руками при манипуляции;

6)немедленно удаляйте любые загрязнения и пролитые жидкости, протирая затем поверхность 70%-м этанолом, иначе они могут попасть на фильтр и нарушить ламинарный поток воздуха, а что хуже – привести к развитию микробной контаминации;

7)по окончании работы выгружайте абсолютно все предметы из рабочей камеры бокса, а затем снова протирайте поверхности камеры бокса безворсовой салфеткой и 70%-м

раствором этанола.

Реактивы и среды, полученные от промышленного производителя, должны до продажи предварительно подвергаться строгому контролю на стерильность, однако наружная поверхность бутылей и флаконов, в которых они содержатся, не стерильна. Некоторые производители обтягивают бутыли полиэтиленовой пленкой, которая защищает от грязи и позволяет помещать их в водяную баню для размораживания или согревания. Эту пленку следует удалять с бутыли вне бокса микробиологической безопасности. Бутыли после водяной бани или холодильника, освобожденные от упаковки, как и любой другой используемый в работе предмет (в т.ч. культуральные емкости, вынутые из инкубатора), перед внесением в рабочую камеру бокса микробиологической безопасности должны быть обработаны 70%-м этанолом и быть сухими. Протирание иногда приводит к смыванию надписей, поэтому используйте этанол-устойчивый маркер.

Существуют различные мнения по поводу того, повышает или увеличивает количество микроорганизмов на коже рук частое мытье. Независимо от результатов этой дискуссии, мытье очищает руки и удаляет сухие клетки кожи, которые, в противном случае, могли бы попасть в культуру. Мытье рук также снизит зараженность слабо прикрепленными микроорганизмами, которые представляют наибольший риск для культуры. При работе с культурами клеток обязательно ношение перчаток, которые каждый раз перед помещением в рабочую камеру бокса предварительно обрабатываются 70% раствором этанола.

При работе в боксе микробиологической безопасности разговоры следует свести до минимума. Если у вас простуда, наденьте маску, или, еще лучше, — не проводите никаких работ с культурами тканей, хотя бы в период выраженного инфекционного процесса.

Манипуляции с культуральными ёмкостями (слайд 29)

При работе в боксе микробиологической безопасности нельзя допускать, чтобы ваши руки или другие предметы находились над культуральными ёмкостями. Особенно, это касается работы с чашками Петри и многолуночными планшетами.

Возможность контаминации чашек Петри и многолуночных планшетов повышается в связи со следующими факторами:

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

1)наличие большой площади поверхности, когда емкости открыта;

2)возникновение риска прикосновения к краю открытых чашки или планшета при манипуляциях;

3)риск переноса контаминантов с рабочей поверхности камеры бокса на чашку или планшет через крышку, если её кладут краем вниз;

4)на крышке может образовываться конденсат или среда, заполняющая промежуток между крышкой и чашкой в связи с явлением капиллярности, если чашку наклоняли или встряхнули при переноске в инкубатор. Это может привести к нежелательному разбрызгиванию жидкости при резком снятии крышки.

5)влажная атмосфера СО2 инкубатора повышает риск заражения, поскольку чашки и

планшеты негерметичны.

Соблюдение следующих правил минимизирует риск заражения:

1)не оставляйте чашки и планшеты открытыми на продолжительный период, тщательно следите за открытыми чашками и крышками. Используйте планшеты, у которых крышечки снабжены небольшими выступами для минимизации контакта с рабочей поверхностью бокса и, как следствие, контаминации;

2)при передвижении чашек по рабочей поверхности и перемещении их в инкубатор или из него старайтесь не наклонять и не трясти чашки и планшеты, чтобы избежать попадания среды на края или крышку и предотвращения заполнения промежутка между крышкой и чашкой или планшетом, ведущего к контаминации вследствие явления капиллярности;

3)используйте вентилируемые чашки и планшеты (с ребрышками); а если среда попала в пространство между чашкой или планшетом, снимите крышку, тщательно удалите среду на наружной поверхности края чашки или планшета ватным тампоном, смоченным 70%- м этанолом, и замените крышку на новую. Убедитесь, что маркировка располагается на

дне чашки Петри!

Культуральные флаконы, особенно с вентилируемой крышечкой обеспечивают наилучшую защиту клеток от контаминации. Однако неправильная работа с ними может снизить уровень защиты. Чтобы этого не произошло важно соблюдать несложные правила:

1)при перемещении культуральных флаконов не допускайте касания внутреннего жидкого содержимого крышечки, особенно крышечки с фильтром, который может намокнуть и, как следствие, потерять свои фильтрующие свойства;

2)культуральные флаконы должны лежать горизонтально, когда их открывают в боксе микробиологической безопасности, а при манипуляциях следует держать их под углом;

3)крышечки флакона при снятии лучше всего класть набок для избежания их контаминации. Если крышечку класть резьбой вниз, существует риск контаминации краев от плохо обработанной рабочей поверхности бокса. Если крышечку класть резьбой вверх, контаминация может возникнуть в результате нарушения ламинарного чистого потока воздуха при движении руками или другими предметами над крышечкой. Однако, все

крышечки, за исключением тех, что производятся компанией Eppendorf, круглый, без граней, и поэтому укатываются.

Асептическое дозирование (слайд 30)

Дозирование ртом должно быть категорически исключено, поскольку оно является дополнительным фактором микробного заражения и может представлять биологическую опасность для оператора, например, при работе с вирусинфицированными клеточными линиями, биопсийным или аутопсийным материалом от человека, или другими объектами, обладающими потенциальной биологической опасностью.

Для этих целей всегда используйте дозатор для серологических пипеток, который должен подходить к пипеткам всех используемых размеров без применения каких-либо усилий для вставления и удаления пипеток. Регуляция потока жидкости должна быть легкой и быстрой. Устройство должно позволять многократно засасывать и выливать из пипетки жидкость (например, при суспендировании) без разбрызгивания, быть легким и удобно располагаться в руке так, чтобы длительная работа не вызывала утомление.

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

Каждое дозирование должно осуществляться одним единственным наконечником и одной единственной серологической пипеткой.

Поскольку затруднительно достать до дна сосуда большого объема носиком наконечника дозатора для работы с небольшими объемами, не касаясь при этом внутренней части его горлышка нестерильными частями корпуса, такие дозаторы следует использовать только при работе с маленькими флаконами.

Работа с серологическими пипетками, фасованными в индивидуальные упаковки, требует особой внимательности и аккуратности, поскольку процедура вынимания пипетки из упаковки подвержена риску контаминации и состоит из следующих этапов:

1)взять левой рукой одну серологической пипетки;

2)открыть двумя руками упаковку в верхней части пипетки, не касаясь при этом самой пипетки;

3)неполностью расслоить концы упаковки, поворачивая их снаружи внутрь и не касаясь при этом пипетки;

4)удерживая в левой руке раскрытую пипетку за ту часть, что находится еще в упаковке, в правой руку взять дозатор для серологических пипеток;

5)удерживая правой рукой дозатор, вставить левой рукой конец пипетки в адаптер для пипеток дозатора, не прилагая при этом слишком больших усилий;

6)удерживая правой рукой дозатор, левой рукой снять упаковку с пипетки, не касаясь при этом любых нестерильных поверхностей;

7)выбросить обертку в мусорную корзину, стоящую рядом с боксом (как вариант, при

небольшой загрузке камеры бокса упаковку можно оставить в левой части рабочей поверхности бокса).

Пипетка в дозирующем устройстве должна располагаться в правильном направлении и под правильным углом в вашей руке. Проследите, чтобы кончик пипетки не касался внешней стороны бутылки или внутренней поверхности бокса. Если это произошло, в обязательном порядке снимите пипетку на новую. Всегда следите, где находится пипетка. Выполнение этой процедуры нелегко, когда вы овладеваете методами асептики, но это важное требование для успешной работы и со временем вы приобретете опыт.

Дозирование в культуре клеток часто представляет собой компромисс между точностью и скоростью выполнения работы; скорость требуется для того, чтобы свести к минимуму повреждение клеток при манипуляциях с ними, в т.ч. субкультивировании, а аккуратность и точность — для воспроизводимости результатов при стандартных условиях культивирования. Тем не менее приемлемая ошибка обычно составляет ±5%, кроме таких условий эксперимента, когда может потребоваться большая точность.

Асептическая работа с жидкостями (слайд 31)

Не переливайте жидкости из одной стерильной емкости в другую. Переливание через горлышко допустимо, если та бутыль, из которой выливают, используется однократно, только чтобы перелить все ее содержимое, предварительно измерив объем, в одно приемное устройство или сосуд. Главный риск при переливании через горлышко заключается в появлении жидкостного мостика между внешней стороной бутылки и внутренней ее стороной, позволяющей микроорганизмам проникнуть внутрь бутылки в ходе хранения или инкубации.

Выливайте жидкости в стакан для отходов при помощи воронки. Фильтровальная воронка предупреждает разбрызгивание содержимого из лабораторного стакана. Как альтернативный вариант, используйте для этих целей бутыли с узким горлышком

Не допускайте образования пузырей и пены при работе с питательными средами и другими культуральными реактивами. Для этого не нужно сильно трясти культуральные емкости, бутыли с питательной средой и т.п., а также не допускать слишком интенсивного дозирования жидкостей. Влияние пенообразования до сих пор не ясно, но при пенообразовании может повышаться скорость денатурации белка, может возникнуть риск контаминации, если пена достигнет горла культурального сосуда. Пенообразование также ограничивает диффузию

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

газов в том случае, если пленка пены или пролившаяся часть попадет в капиллярное пространство между крышкой и флаконом или между крышкой и нижней частью чашки Петри.

Стерилизуйте все нестерильные водные растворы, для которых предполагается контактирование с клетками. Большинство реактивов и сред, если они термостабильны, например, вода, растворы солей, гидролизаты аминокислот, может быть стерилизовано автоклавированием. Термолабильные растворы, например, растворы ферментов и питательные среды, стерилизуются фильтрацией через микропористые фильтры с диаметром пор от 0,1 до 0,2 мкм. Обычно для малых объемов фильтрации (2-20 мл) в условиях лаборатории чаще всего используют фильтрующие насадки, устанавливаемые на шприц, от 13 до 50 мм в диаметре, сделанные из различных материалов, включая полиэфирсульфон (PES), ацетат целлюлозы (CA), смешанные эфиры целлюлозы (MCE), гидрофильный и гидрофобный политетрафторэтилен (PTFE), гидрофильный или гидрофобный поливинилиденфторид (PVDF). PES-мембраны обладают большой пропускной способностью и характеризуются низким связыванием белков.

Выделяют стерильные (обработанные гамма-излучением) и нестерильные шприцевые насадки. Стерильные упакованы в индивидуальную упаковку. При выборе шприцевой насадки следует обратить внимание на её диаметр и размер пор мембраны. Для фильтрации растворов объемом до 2 мл подойдут фильтрующие насадки с диаметром мембраны 4 мм. Для фильтрации объемов от 2 до 10 мл будет достаточно фильтрующей насадки с диаметром 13 мм, для фильтрации растворов более 10 мл следует выбрать фильтрующую насадку с диаметром 25, 30 или 33 мм. Мембраны с размером пор 0,1 мкм используются для удаления микоплазмы, с размером пор 0,22 мкм — для удаления бактерий; с размером пор 0,45 мкм — для очистки растворов, удаления крупных частиц и предочистки для стерильной фильтрации.