ЯГТУ / Профессиональная подготовка специалистов для производства иммунобиологических лекарственных препаратов (вакцин). Направление «Biotechnical» / Лекция №1. Эукариотические клеточные культуры и методы работы с ними

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

ЛЕКЦИЯ №1. ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ И МЕТОДЫ РАБОТЫ С НИМИ

курса ДПО «Upstream» и «downstream» биотехнологические процессы»

Лектор:

Андреева Екатерина Алексеевна, биотехнолог НОЦ МКТ katya.andreeva@pharminnotech.com

Базовая терминология (слайд 2)

Термин «клеточная культура/культура клеток» («cell culture») является обобщенным и обозначает любые эукариотические клетки в условиях in vitro. Основной метод получения клеточных культур заключается в диспергировании (измельчении) донорского образца ткани или органа путем его ферментативной, механической или химической дезагрегации (разделения на части) до состояния дисперсной культуры клеток (одиночных клеток), которая затем культивируется (выращивается) вне организма как монослой на плотном субстрате или как суспензия во всем объеме жидкой питательной среды. Полученная таким образом культура клеток называется «первичной» («primary cell culture»). После первого субкультивирования (или пассажа, т.е. пересева) первичной культуры клеток в новую культуральную ёмкость со свежей питательной средой формируется дочерняя культура, представляющая собой начало «клеточной линии» («cell line»). По мере её последовательного субкультивирования в составе дочерних клеточных линий начинают преобладать клетки с максимальной способностью к росту и с наибольшей устойчивостью к внешним воздействиям, что приводит к определенной степени генотипической и фенотипической однородности клеточной популяции. Обычно уже после третьего пассажа формируется относительно стабильная «клеточная линия», хотя некоторые изменения все же будут продолжаться в ходе дальнейшего субкультивирования.

Конечные и постоянные клеточные линии (слайд 3)

Клеточные линии в зависимости от продолжительности жизни подразделяют на конечные (англ. – finite) и постоянные (англ. – continuous).

Конечные клеточные линии со временем стареют и, рано или поздно, погибают. Это обусловлено тем, что составляющие их клетки способны делиться (удваиваться) лишь ограниченное число раз, которое сильно варьируется для различных клеточных линий и условий культивирования и составляет обычно от 20 до 100 удвоений (генераций). При этом, клетки после своего последнего деления до начала угасания культуры могут оставаться жизнеспособными еще очень продолжительное время, вплоть до 18 месяцев.

Нормальные ткани и органы донора образованы клетками, у которых регуляция процессов старения не нарушена и строго контролируется работой генов старения. Поэтому клеточные линии, полученные из образцов нормального донорского материала, всегда, за единичными исключениями, являются конечными.

Постоянные клеточные линии имеют неопределенную продолжительность жизни и, в некоторых случаях, могут делиться практически бесконечно. Постоянные клеточные линии формируются половыми, стволовыми и опухолевыми клетками, у которых выработаны механизмы защиты от старения.

Однако, из конечной клеточной линии зачастую можно получить постоянную клеточную линию путём её спонтанной (происходящей без вмешательства извне) или индуцированной (вынужденной) химическим или вирусным агентом иммортализации или трансформации, т.е. фенотипических изменений клеточной линии, возникших в результате необратимых изменений в геноме клеток. В первом случае клетки приобретают только «бессмертие», а во втором – помимо «бессмертия», у клеток значительно нарушаются механизмы контроля роста и злокачественности, т.е. они могут приобрести способность образовывать опухоли in vivo.

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

Суспензионные и адгезионные культуры клеток (слайд 4)

Культуры клеток в зависимости от метода культивирования подразделяют на суспензионные (англ. – suspension culture) и адгезионные (англ. – adherent culture).

Суспензионные культуры клеток способны расти и делиться без прикрепления к субстрату, т.е. в виде взвешенных во всем объеме жидкой питательной среды одиночных клеток (иногда клетки объединяются, но это нежелательно).

Адгезионные культуры клеток способны расти и делиться только будучи прикрепленными к субстрату, образуя при этом монослой, поэтому их также называют монослойные культуры клеток (англ. – monolayer culture).

Некоторые культуры клеток способны расти как в виде суспензии, так и в виде монослоя.

Двумерные и трехмерные культуры клеток (слайд 5)

Культуры клеток в зависимости от метода культивирования также подразделяют на двумерные (англ. – two dimensional, 2D) и трехмерные (англ. – three dimensional, 3D).

Двумерные клеточные культуры представляют собой клетки, растущие в виде уже упомянутого монослоя. Данный подход считается классическим и наиболее распространенным. Монослой позволяет всем клеткам получать из окружающей среды одинаковое количество питательных веществ и факторов роста. Кроме того, он состоит преимущественно из делящихся клеток, так как мертвые клетки отделяются от субстрата и легко удаляются при смене питательной среды на новую. Клетки, культивируемые в виде монослоя, обычно более плоские и растянутые в сравнении с клетками in vivo. Аномальная клеточная морфология в двумерной культуре влияет на многие клеточные процессы, включая клеточную пролиферацию (деление клеток), дифференцировку (приобретение клетками определенной морфологии и специализированных функций), апоптоз (запрограммированная гибель клеток), экспрессию генов и белков (процесс синтеза белков на матрице ДНК). В результате поведение клеток с двухмерным культивированием отличается от такового в организме. Как следствие, экспериментальные данные, получаемые на двумерных культурах клеток, могут быть недостоверными и ненадежными.

В связи с этим всё бо́льшую популярность приобретают трехмерные клеточные культуры, которые представляют собой плотно упакованные агрегаты (объединения) клеток, образующие в пространстве структуру в виде сферы, поэтому их также называют клеточные сфероиды (англ.

– spheroids). Культивирование в виде трехмерных структур характеризуется естественным ростом клеток, при котором сохраняются межклеточные взаимодействия, контакты с внеклеточным матриксом и микросредой, что делает их более приближенными к клеткам в условиях in vivo. Данное направление активно развивается и на сегодняшний получены многоклеточные сфероиды (т.е. состоящие из двух и более различных типов клеток), в состав которых входят клетки, выполняющие тканеспецифические функции. Так, например, ученым в 2014 году удалось сконструировать в пробирке искусственный мини-желудок человека

(doi.org/10.1038/nature13863).

Морфология клеток in vitro (слайд 6)

Клетки, культивируемые в условиях in vitro, в зависимости от морфологии (внешнего вида) подразделяют на три группы: фибробластные (англ. – fibroblastic) или фибробластподобные (англ. – fibroblast-like), эпителиальные (англ. – epithelial) или эпителий-подобные (англ.

– epithelial-like) и лимфобласт-подобные (англ. – lymphoblast-like). Термины «фибробластный» и «эпителиальный» используются достаточно приблизительно и часто описывают скорее внешний вид, чем происхождение клеток. Тем не менее, когда идентичность (происхождение) клеток не подтверждается, должен использоваться термин «фибробласт-подобные» или «эпителийподобные» клетки.

Следует отметить, что большинство клеток обладают пластичной морфологией, т.е. способны изменять свою форму в ответ на культивирование в различных условиях. Таким образом, сравнительное изучение клеток должно всегда проводиться при одинаковой клеточной плотности, на одной и той же стадии роста, в одной и той же питательной среде или на одном и том же субстрате.

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

Фибробластные или фибробласт-подобные клетки – это адгезионные клетки, которые обычно неупорядоченно распластаны на поверхности субстрата при низкой плотности клеток (субконфлюентный монослой, в котором клетки занимают не всю поверхность субстрата), растут параллельными рядами при высокой плотности клеток (конфлюентный монослой, в котором все клетки контактируют друг с другом и занимают всю поверхность субстрата) и имеют биполярную (веретенообразную) или мультиполярную (звездчатую) вытянутую форму с длинными выростами.

Эпителиальные и эпителий-подобные клетки (слайд 7)

Эпителиальные и эпителий-подобные клетки – это также адгезионные клетки, которые растут островками отдельно от других клеток и имеют более правильную полигональную (многоугольную) форму с ровными краями и ясными четкими границами между клеток. Эпителиальные клетки, растущие в центре конфлюентного монослоя, обычно имеют правильную полигональную форму, с ясно очерченными краями, в то время как те же клетки, растущие на краю монослоя, могут иметь менее правильную, форму, отличающуюся разнообразием, а при трансформации могут принимать фибробласт-подобную форму.

Лимфобласт-подобные клетки (слайд 8)

Лимфобласт-подобные клетки – это суспензионные клетки, которые имеют сферическую форму.

Главный компартмент эукариотической клетки – ядро (слайд 9)

При исследовании эукариотической клетки в световом микроскопе наиболее крупным и хороши видимым компартментом для исследователя будет ядро. Ядро содержит бо́льшую часть генетической информации (некоторая часть ДНК содержится в митохондриях, а у растительных клеток еще и в хлоропластах). Кроме того, ядро осуществляет сложный механизм регуляции экспрессии генов (экспрессия генов – это реализация генетической информации, т.е. синтез белка на матрице РНК). В ядре происходят такие процессы как репликация ДНК (удвоение ДНК), транскрипция РНК (синтез РНК), а также РНК проце́ссинг (посттранскрипционные модификации молекул РНК, или «созревание» молекул РНК).

Основными структурными элементами ядра являются: ядерная оболочка, нуклеоплазма, хроматин, ядерные немембранные субкомпартменты, наиболее известным из которых является ядрышко.

Морфология ядра – это тот замечательный признак, благодаря которому исследователи могут хорошо отличить одну клетку от другой клетки, потому что морфология ядра сильно варьируется в зависимости от типа организма (животная, растительная, бактериальная, грибная клетки – все они очень сильно отличаются в своем строении друг от друга), от клеточной специализации (так, например, у человека идентифицировано около двух ста различных видов клеток, каждая из которых имеет уникальную, неповторимую морфологию), а также от стадии клеточного цикла (ядро клетки, находящейся в стадии интерфазы, очень сильно отличается от митотической, т.е. делящейся клетки).

Диаметр ядра колеблется от одного микрона (и такие ядра обнаружены, например, у Saccharomyces cerevisiae – пекарских дрожжей) до 400 мкм (таким ядром обладают ооциты, т.е. яйцеклетки лягушки Xenopus laevis, благодаря чему эти ооциты являются любимой клеточной моделью по исследованию ядерно-цитоплазматического транспорта веществ), однако, в среднем, для животных клеток ядро не превышает 10 мкм. Для наглядности можно привести сравнение с человеческим волосом. Человеческий волос в диаметре составляет примерно 100 мкм, следовательно, десять таких ядер может поместиться на диаметр вашего волоса.

Наиболее распространённая форма ядра – сферическая, однако часто встречаются и удлиненные различные формы ядер, например, в виде фасоленки, сигары, пончика, надкусанного пончика, яичницы и многие другие.

Большинство клеток содержит одно ядро, однако есть и многоядерные, и безъядерные эукариотические клетки. Многоядерные клетки могут образоваться, например, в результате слияния нескольких клеток. Безъядерные эукариотические клетки, например, эритроциты, обычно образуются в результате дифференцировки.

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

Области применения культур клеток (слайд 10)

Культура клеток является одной из самых важных техник, используемой в клеточной и молекулярной биологии. Клеточные модели успешно и активно применяются в исследованиях физиологии, патофизиологии и биохимии клеток. Кроме того, на клеточных моделях оценивают цитотоксичность и эффективность потенциальных лекарственных соединений. Также они используются в разработке и крупномасштабном производстве иммунобиологических препаратов, таких как противовирусные вакцины и моноклональные антитела.

Перспективные возможности имплантации нормальных клеток от здорового человекадонора или подходящих фетальных клеток больному, а также пересадка генетически измененных клеток от самого пациента привели к созданию целой ветви метода культуры клеток, которая получила название тканевая инженерия.

Преимущества культуры клеток (слайд 11)

Преимуществами техники культуры клеток, которые обуславливают её широкое применение в научно-исследовательских работах и на производстве, являются, во-первых, однородность клеточных линий, при которой их характеристики могут сохранятся в нескольких поколениях и быть неизменными при замораживании и хранении в жидком азоте. Это, в свою очередь, позволяет получать воспроизводимые результаты.

Кроме того, в культурах клеток можно осуществить непосредственное воздействие на клетки определенных низких концентраций реагентов, т.е. существует возможность определять и контролировать дозу, концентрацию и время действия реагентов на клетки. Следовательно, для достижения аналогичного эффекта требуется использование меньших концентраций реагентов, чем in vivo, где до 90% действующего вещества теряется при выведении и распределении по другим тканям, которые не изучаются в данном эксперименте. Проведение скрининговых исследований с большим количеством параметров и использованием самовоспроизводящихся клеток дешевле, при этом исчезает необходимость решения юридических, моральных и этических вопросов, связанных с экспериментами на животных. Роботизация процесса также вносит значительный вклад в экономию времени и объема работы.

Однако, главное преимущество техники культуры клеток заключается в возможности очень точного контроля физико-химических свойств окружения (pH, температуры, осмотического давления, парциального давления растворенных газов) и физиологических условий (гормонов и концентраций питательных веществ), при которых культивируются клетки.

Питательные среды для культивирования клеток (слайд 12)

Питательная среда (англ. – culture medium) является наиболее важным компонентом окружающей среды клеток in vitro, поскольку в ней содержаться необходимые для роста и деления клеток вещества. В ранних исследованиях для культивирования клеток использовали природные среды на основе тканевых экстрактов и естественных жидкостей организма, таких как экстракт куриного эмбриона, сыворотка, лимфа и т. д. С распространением клеточных линий потребность в бо́льшем количестве сред стандартного однородного качества привела к внедрению сред с химически точным определенным составом, основанным на анализе естественных жидкостей организма и биохимии питательных веществ.

Наиболее часто используемыми коммерческими базальными (минимальными) средами на сегодняшний день являются среда Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640),

минимальная среда Игла (Minimum Essential Medium, MEM), среда Игла в модификации Дульбекко (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM) и среда Хэма (Ham's F-12 Nutrient Mixture, F-12).

Всостав коммерческих базальных сред входят такие вещества, как протеиногенные аминокислоты, витамины, неорганические соли и глюкоза. Однако базальные среды должны быть дополнены сывороткой.

Всостав сыворотки входят белки, функции которых in vitro до конца неизвестны, незаменимые аминокислоты, факторы роста, которые способствуют клеточной пролиферации, вещества, ингибирующие пролиферацию, факторы адгезии и вещества, обладающие антитрипсиновой активностью, способствующие прикреплению клеток. Сыворотка также

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

является источником минеральных веществ (например, селена), липидов и гормонов. Для большинства клеточных культур используются телячья сыворотка, эмбриональная бычья сыворотка, сыворотка взрослых лошадей и человеческая сыворотка. Телячья и эмбриональная бычья сыворотки используются наиболее широко, в особенности последняя, которую применяют для большинства требовательных линий клеток. Человеческая сыворотка иногда используется для культивирования некоторых линий клеток человека, но ее необходимо проверять на вирусы, такие как ВИЧ и гепатит В. Для некоторых исследований лошадиная сыворотка предпочтительнее телячьей, так как она может быть получена из закрытого донорского сердца и часто ее свойства меньше варьирует от серии к серии. Различие в качестве и составе сыворотки от партии к партии обусловлено разными методами её приготовления и стерилизации, различным сроком и условиями хранения, а также зависит от породы животных, у которых берут сыворотку, от их рациона, климата, в котором животных выращивают и от других условий окружающей среды. Всё это затрудняет стандартизацию сыворотки, при этом одна партия может храниться от шести месяцев до года при -20 °С. Поэтому важно выбрать серию сыворотки и использовать ее как можно дольше и заменить ее со временем на максимально сходную по свойствам. Вариабельность сыворотки и опасность контаминации послужили причиной для разработки бессывороточных сред и сред с пониженным содержанием сыворотки. Данные среды обеспечивают более стабильную производительность, повышенную продуктивность, более легкую очистку целевого продукта, лучший контроль клеточных ответов, лучший мониторинг клеточных продуктов синтеза и обмена веществ. Однако такие среды не приобрели большой популярности, поскольку являются достаточно дорогостоящими и подходят для небольшого числа клеточных линий.

Подробнее о составе питательных сред (слайд 13)

Основу многих жидких питательных сред составляют сбалансированные солевые растворы, в состав которых входят неорганические соли. Наиболее распространенными сбалансированными солевыми растворами, используемыми для приготовления жидких питательных сред, являются соли Хэнкса и соли Эрла. Соли Хэнкса применяют при культивировании клеток в закрытых флаконах в атмосфере воздуха, в то время как соли Эрла применяют при высокой концентрации в среде бикарбоната в сочетании с 5% СO2 в газовой фазе и в вентилируемых флаконах. BSS также используется для разбавления концентратов аминокислот и витаминов при приготовлении питательной среды, для изотонических промывок или при препарировании и для кратковременной инкубации клеток (до 4 ч, обычно с добавлением глюкозы). Кроме того, состав BSS часто модифицируют.

Большинство клеток хорошо растут при pH 7,4, хотя оптимальные значения pH могут варьироваться в относительно небольшом диапазоне для разных клеточных линий. Изменение pH среды в сильнокислую или сильнощелочную сторону отрицательно сказывается на состоянии клеток в культуре, и поэтому необходимом вовремя предпринимать меры для восстановления физиологических значений pH среды, например, заменить старую питательную среду на новую. Для того, чтобы не упустить такое изменение питательной среды, в качестве индикатора pH обычно используется феноловый красный, который и придает питательной среде окраску в зависимости от её значения pH. При pH 7,4 он красного цвета, при pH 7,0 становится оранжевым, при pH 6,5 – желтым и лимонно-желтым при более кислых значениях pH. При pH 7,6 цвет индикатора сдвигается в розовую область, при pH 7,8 становиться фиолетовым. Так как оценка цветов во многом субъективна, полезно приготовить набор стандартных растворов стерильного сбалансированного солевого раствора, содержащего феноловый красный в необходимой концентрации, в такой же бутыли и с таким же объемом для воздуха, которые обычно используются для приготовления сред.

Для поддержания pH в диапазоне физиологических значений при проведении продолжительных манипуляций в отсутствии атмосферного CO2 в питательную среду может быть добавлен буфер HEPES в концентрациях 10-20 мМ, который по сравнению с бикарбонатным является гораздо более сильным буфером в диапазоне pH 7,2-7,6. Однако, несмотря на низкую буферную емкость при физиологических pH, бикарбонатный буфер все еще

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

используется намного чаще, благодаря его низкой токсичности, дешевизне и питательной пользе для культуры.

Другие добавки (слайд 14)

Для культивирования клеток требуются незаменимые аминокислоты (т.е. те, которые не синтезируются в организме) (англ. – essential amino acids), цистин и/или цистеин, аргинин, глутамин и тирозин. Потребность в индивидуальных аминокислотах может варьироваться у клеток различных типов. Концентрация аминокислот обычно определяет максимальную плотность культуры и при достижении равновесия влияет на выживаемость клеток и скорость их роста. Для большинства клеток требуется глутамин, хотя некоторые клеточные линии могут использовать глутаминовую кислоту; имеются данные, что глутамин используется культивируемыми клетками в качестве источника энергии и углерода вместо глюкозы. Это может объяснить исключительно высокие требования некоторых культур к глутамину или глутамату. Поскольку глутамин в водном растворе способен распадаться с образованием аммония, токсичного для клеток, его добавляют в питательную среду непосредственно перед началом культивирования. При этом срок хранения такой среды не должен превышать 3 недель. Равноценной альтернативой глутамину является добавка под торговым названием Глутамакс (Glutamax), которая представляет собой более стабильный дипептид аланин-глутамин. Клетки самостоятельно расщепляют пептидную связь для высвобождения глутамина в случае такой необходимости. Такой подход предотвращает накопление токсичного аммония и поддерживает свежий запас глутамина во время продолжительного культивирования. Как следствие, улучшается жизнеспособность клеток.

Помимо незаменимых, в базальную питательную среду могут добавляться заменимые аминокислоты (англ. – non-essential amino acids), которые и так уже в ней присутствуют, также с целью увеличения роста и жизнеспособности клеток.

Антибиотики, как правило, добавляют в ростовую среду для того, чтобы снизить риск контаминации микроорганизмами, в том числе – бактериями, микоплазмой и микроскопическими грибами. Однако антибиотики обладают рядом серьезных недостатков. Так, например, помимо того, что антибиотики маскируют присутствующих в небольшом количестве скрытых контаминантов, при взаимодействии с клетками млекопитающих антибиотики могут действовать как антиметаболиты – вещества, нарушающие центральные биохимические реакции клеток, что, в конечном итоге, приводит к клеточной гибели. Кроме того, было показано, что систематическое культивирование клеток с добавлением в ростовую среду наиболее часто используемых антибиотиков (смеси пенициллин-стрептомицин или гентамицина) в стандартных концентрациях приводит к глобальным изменениям экспрессии генов и упаковки хроматина. Это, в свою очередь, влияет на метаболические пути, связанные с клеточным ответом на воздействие лекарственными веществами, а также на пролиферацию клеток, их рост и дифференцировку. Таким образом, антибиотики приводят к изменению функционального состояния клетки, которое значительно отличается от состояния клеток в условиях in vivo. Как следствие, результаты, полученные на клеточных моделях, культивируемых с применением антибиотиков, могут быть сильно искажены, особенно в исследованиях, посвященных клеточному ответу на воздействие лекарственными веществами, а также регуляции клеточного цикла, дифференцировке и росту.

Поэтому настоятельно рекомендуется рутинное культивирование проводить в отсутствие антибиотиков; применение антибиотиков ограничить первичными культурами или продолжительными дорогостоящими лабораторными экспериментами. Если условия требуют применения антибиотиков, они должны потом быть удалены так быстро, как только возможно. Если антибиотики используются в течение продолжительного времени, необходимо параллельно культивировать клетки без антибиотиков. Ряд антибиотиков, используемых в культуре клеток, обладают умеренной эффективностью в отношении бактериальных инфекций. Однако у многих бактериальных штаммов развилась устойчивость к антибиотикам, как естественным путем, так и в результате селекции. Таким образом, контроль контаминации с помощью антибиотиков никогда не будет абсолютным. Особенно трудно контролировать контаминацию грибами и

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

дрожжами, размножение этих микроорганизмов можно сдержать, но уничтожить их удается только в редких случаях.

Выбор подходящей ростовой среды (слайд 15)

Информацию относительно выбора подходящей среды для данного типа клеток обычно можно найти в литературе – в статьях, где описано получение клеточной линии или сходной культуры клеток. Информацию также можно получить от того, кто предоставляет клеточную линию. Банки клеток, такие как АТСС (Американская коллекция клеток) и ЕСАСС (Европейская коллекция клеток), предоставляют информацию о средах, которые используются для доступных в настоящее время линий клеток, и эту информацию можно просмотреть на их веб-сайтах. В случае если информация отсутствует, приходится либо эмпирически подбирать среду, либо провести сравнительное тестирование нескольких сред так же, как и при выборе сыворотки.

Если информация недоступна, за две недели можно провести простые эксперименты по исследованию эффективности роста клеток на коммерческих доступных средах. Для вас может оказаться сюрпризом, если удастся подобрать лучшие условия для культивирования клеток, которые не согласуются с литературными данными; воспроизвести условия, созданные в другой лаборатории, может быть сложно из-за вариаций в приготовлении сред или разных поставщиках, из-за примесей, присутствующих в реактивах и воде, разницы между сериями сыворотки. Остается надеяться, что при снижении необходимости использования сыворотки и повышении чистоты реактивов стандартизация среды будет совершенствоваться. ной сыворотки. Если вы сможете, полностью избавьтесь от сыворотки или снизьте ее концентрацию и используйте бессывороточные составы.

Физико-химические свойства окружения клеток in vitro (слайд 16)

Как уже было отмечено, экстремальные значения pH питательный среды могут быть губительны для клеток в культуре, поэтому питательная среда для поддержания физиологических значений pH должна обладать буферными свойствами. Обычно буферизация питательной среды достигается за счет CO2-бикарбонатной буферной системы. Поскольку pH среды зависит от тонкого баланса растворенного диоксида углерода (CO2) и бикарбонат-иона (HCO3–), изменения в атмосферном CO2 могут изменить pH среды. Следовательно, при использовании сред на основе бикарбоната, необходимо использовать экзогенный CO2, особенно если клетки культивируются в открытых культуральных емкостях, или трансформированные клетки культивируются при высоких концентрациях. В большинстве экспериментов с культурами клеток обычно используется 4–10% CO2. Однако для каждой среды есть рекомендуемые концентрации бикарбоната и парциального давления СO2 для достижения правильных значений pH и осмотического давления, но могут быть небольшие вариации в зависимости от метода приготовления среды.

Включение в состав среды пирувата позволяет клеткам увеличить продукцию эндогенного СO2, делая их независимыми как от экзогенного СO2, так и от бикарбоната. Среда Лейбовица L15 содержит пируват натрия в высокой концентрации (550 мг/мл) и не содержит бикарбонат, и не требует присутствия СO2 в газовой фазе. Буферизация в данном случае достигается благодаря относительно высокой концентрации аминокислот. Так как данная среда не требует СO2, L15 иногда рекомендуют использовать для транспортировки образцов тканей.

Обобщая вышесказанное, подчеркнем, что клетки, культивируемые во флаконах с доступом воздуха, необходимо инкубировать в атмосфере СO2, концентрация которого находится в равновесии с бикарбонатом натрия, содержащимся в среде. Клетки в умеренно высокой концентрации (>1x105 клеток/мл) и растущие в закрытых флаконах, не нуждаются в добавлении СO2 в газовую фазу при условии, что концентрация бикарбоната поддерживается низкой (=4 мМ), особенно если клетки сильно закисляют среду. Однако при низкой концентрации клеток (например, при клонировании) и для некоторых первичных культур необходимо добавлять СO2 в газовую фазу и при культивировании клеток в закрытых флаконах. Когда требуется вентиляция для достижения равновесия (либо для допуска С02, либо для удаления его избытка для сильно закисляющих среду клеток), необходимо оставлять крышки флаконов приоткрытыми или использовать крышки, пропускающие СO2.

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

Оптимальная температура для культивирования клеток зависит от температуры тела животного, из которого клетки были получены, некоторых анатомических вариаций (например, температура кожи и тестикул может быть ниже температуры покоящегося тела) и учета фактора безопасности, так как могут иметь место небольшие ошибки в регулировке оборудования. Таким образом, в целях безопасности, для большинства клеточных линий человека и теплокровных животных рекомендуется температура 37 °С, которая немного ниже температуры тела, так как перегревание является более серьезной проблемой, чем переохлаждение.

Культивируемые клетки млекопитающих устойчивы к значительному понижению температуры, они выживают в течение нескольких дней при 4°С и могут быть заморожены и охлаждены до -196 °С, но не выдерживают нагрева выше нормы более чем на 2 °С (39,5°С) более чем на несколько часов и очень быстро погибают при температуре 40°С и выше.

Не считая прямого эффекта на рост клеток, температура может также влиять на pH из-за повышения растворимости СO2 при низких температурах и, возможно, из-за изменений степени ионизации буфера.

Культуральные ёмкости (слайд 17)

Основной культуральной посудой, используемой для культивирования клеток in vitro в масштабах лаборатории, являются культуральные флаконы, чашки Петри и многолуночные планшеты.

Определяющими факторами при выборе культуральной посуды являются: требуемое количество клеток; характер роста культуры – суспензионный или прикрепленный; необходимость в аэрации или герметизация культуры; порядок забора образцов; характер анализа культуры и стоимость.

Для монослойных культур количество клеток пропорционально площади поверхности флакона, а для суспензионных количество клеток зависит от объема питательной среды при условии, что культура будет эффективно перемешиваться и аэрироваться. Для малых объемов и выращивания культуры для параллельных исследований (опытов) наилучшим образом подходят многолуночные планшеты, которые могут иметь большое количество маленьких лунок или, наоборот, маленькое количество больших лунок (на 4, 6, 12, 24, 96, и 144 лунки). Обычно используют как чашки Петри, так и флаконы в диапазоне размеров от 10 см2 до 225 см2. Флаконы, как правило, маркируют согласно площади рабочей поверхности (например, 25 см2 или 175 см2, а иногда Т25 или Т175 соответственно), в то время как чашки Петри обозначают по их диаметру

(т.е. 35 мм, 60 мм или 90 мм).

Клетки, растущие в суспензии, могут культивироваться во флаконах, в плашках или чашках Петри, которые не требуют дополнительной обработки для обеспечения клеточной адгезии. Как правило, для работы с суспензионными культурами клеток используют культуральную посуду, с маркировкой «non-treated», т.е. «не обработано» – внутренние поверхности культуральной емкости ничем не обработаны и не обеспечивают адгезию клеток.

Однако, большинство клеток позвоночных, культивируемых in vitro, растут в виде монослоя на искусственном субстрате. Следовательно, субстрат должен иметь правильный заряд, чтобы позволить прикрепиться клеткам или, по крайней мере, сорбировать факторы клеточной адгезии, которые, в свою очередь, дадут возможность клеткам прикрепиться и распластаться.

Стекло было первым субстратом благодаря своим оптическим свойствам и поверхностному заряду. Однако в настоящее время стекло заменено в большинстве лабораторий на синтетический пластик, который обладает большей плотностью и лучшими оптическими характеристиками. Сейчас стекло используется редко, хотя оно является дешевым, легко моется, не утрачивая при этом поддерживающих клеточный рост свойств.

Одноразовые стерильные флаконы из полистирола представляют собой простой, воспроизводимый субстрат для культивирования. Они обычно обладают хорошими оптическими свойствами, а поверхность является достаточно плоской для перевиваемых монослойных культур с равномерным ростом. Промышленно произведенный полистирол является гидрофобным субстратом, к которому клетки не способны прикрепиться, поэтому

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

культуральный пластик обрабатывают коронным разрядом, газоразрядной плазмой, γ-радиацией или же химическими стентами для формирования заряженной смачиваемой поверхности.

Несмотря на то, что полистирол является наиболее широко используемым и дешевым пластмассовым субстратом, клетки также могут расти на поливинилхлориде (PVC), поликарбонате, политетрафторэтилене (PTFE; Teflon), Melinex, Thermanox (ТРХ) и на ряде других пластмасс.

На культуральной посуде для работы с адгезионными клетками обязательно должна стоять маркировка «treated», т.е. «обработано».

Вентилирование (слайд 18)

Многолуночные планшеты и чашки Петри имеют свободную крышку, которая не закручивается и не плотно прилегает – для обеспечения удобного и быстрого доступа внутрь емкости. Как следствие, они не герметичны и нуждаются в поступлении влажного атмосферного воздуха с контролируемой концентрацией СО2. Так как по окружности внутренней поверхности крышки может формироваться тонкая пленка жидкости, герметизирующая некоторые чашки, то необходимо использовать вентилируемые крышки со специальными опорными элементами. В случае, если требуется полная герметизация, планшеты и чашки можно оборачивать пленкой

Parafilm.

Флаконы могут вентилироваться за счет неполного закручивания крышки до определенного фиксированного положения для доступа СО2 или, наоборот, для выхода избытка СО2. Однако, для поддержания правильного газообмена предпочтительнее всего использовать крышки с проницаемыми фильтрами, так как они пропускают СО2 без риска контаминации.

Краевой эффект (слайд 19)

Следует отметить, что обычно при работе с 96-луночными планшетами внешние лунки, расположенные по периметру, не используются по причине повышенного испарения жидкости, что снижает воспроизводимость и сопоставимость результатов эксперимента между всеми лунками (т.н. «краевой эффект»). Вместо этого, во внешние лунки, как правило, добавляют питательную среду без клеток или просто стерильную дистиллированную воду.

На сегодняшний день эту проблему можно решить с помощью специально сконструированных планшетов, у которых по периметру имеются канавки для заполнения их жидкостью. Это позволяет минимизировать краевой эффект и использовать все 96 лунок планшета, тем самым снижая затраты на культуральный пластик. Кроме того, вы можете заполнить жидкостью всё внутреннее пространство планшета для более равномерного распределения температуры питательной среды и эффективного сохранения температур от лунки к лунке при проведении манипуляций над клетками вне инкубатора.

Основное оборудование – инкубатор (слайд 20)

Основным оборудованием, создающим необходимые температурные и атмосферные условия для культивирования клеток in vitro, является инкубатор. Инкубатор должен быть снабжен принудительной вентиляцией, температурным контролем с точностью до ±0,2 °С и термостатом безопасности, который прекратит нагревание, выключив инкубатор, если температура превысит необходимую, или, что лучше, примет на себя функцию регуляции работы инкубатора, если основной термостат сломается. Инкубатор должен быть устойчив к коррозии и легок для уборки. Частая уборка инкубатора – это важный элемент его эксплуатации, поэтому внутреннее пространство должно легко разбираться, не оставляя недоступных для мытья частей и углов.

Полки инкубатора обычно перфорированы для улучшения циркуляции воздуха. Однако перфорация может привести к неравномерности распределения клеток в монослойных культурах и различию в клеточной плотности в образцах, располагающихся на разных полках. Такие различия могут возникнуть и в результате конвекционных потоков, возникающих над точками контактов чашек с полками по сравнению с отверстиями в полках, либо могут иметь отношение к областям местного охлаждения, возникающим при открывании дверей. Хотя при рутинных манипуляциях обычно такие проблемы не возникают, при выполнении экспериментов, в которых

Научно-образовательный центр молекулярных и клеточных технологий ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России

однородная плотность культуры важна, следует помещать флаконы и чашки на изолирующий кафель или металлический поддон.

Существует два типа инкубаторов:

1)сухие инкубаторы;

2)влажные CO2-инкубаторы.

Всухих инкубаторах создаются и регулируются только температурные условия, поэтому

вних могут культивироваться клетки в закрытых флаконах, в питательных средах, приготовленных на сбалансированном солевом растворе Хэнкса.

Во влажных CO2-инкубаторах поддерживаются и контролируются на заданном уровне температура, влажность и концентрация CO2. В таких инкубаторах культивируются клетки в многолуночных планшетах и чашках Петри, но также можно и во флаконах. При этом высокий уровень влажности (95-100%) предотвращает испарение жидкости из культуральных ёмкостей. Как правило, влажность поддерживается с помощью поддонов воды, расположенных либо внутри, либо вне камеры инкубатора.

Размеры инкубатора определяются потребностями лаборатории – как количеством сотрудников, пользующихся им, так и типами культур, с которыми они работают. При этом, экономически невыгодно инкубировать в СО2-инкубаторах флаконы, особенно больших размеров. Для этих целей лучше использовать обычные инкубаторы или термальные комнаты. Если требуется СО2, то крышечка флаконов должна быть не до конца закрыта или иметь встроенный фильтр, пропускающий газ внутрь.

Бокс микробиологической безопасности (слайд 21)

Главное рабочее место в лаборатории клеточных культур, где осуществляется асептическая работа с культурами клеток, представлено боксом микробиологической безопасности (англ. – microbiological safety cabinet, MSC).

Заражение микроорганизмами является главной проблемой культивирования клеток. Бактерии, микоплазмы, дрожжи и споры грибов могут попасть в культуру через оператора, из воздуха, с рабочей поверхности, из растворов и многих других источников. Следовательно, все материалы, которые непосредственно контактируют с культурой, должны быть стерильны, а все манипуляции должны проводиться так, чтобы не было прямого контакта между культурой и нестерильным окружением.

Согласно ГОСТ Р ЕН 12469-2010 Биотехнология. Технические требования к боксам микробиологической безопасности, «бокс микробиологической безопасности – это вентилируемое ограниченное пространство, предназначенное для обеспечения защиты оператора и окружающей среды от аэрозолей, возникающих вследствие работы с потенциально опасными и опасными микроорганизмами, с помощью удаления воздуха в атмосферу путем фильтрации».

Боксы микробиологической безопасности в зависимости от уровня обеспечиваемой защиты классифицируются на I, II и III класс, где I класс обеспечивает защиту только оператора; II класс обеспечивает защиту оператора, а также обеспечивает низкий риск загрязнения продукта и перекрестной контаминации; а III класс полностью изолирует рабочую зону бокса и отделяет оператора от рабочего места физическим барьером (т.е. механическими перчатками, соединенными с боксом). На практике большинство лабораторий используют боксы микробиологической безопасности II класса (MSC class II).

Бокс микробиологической безопасности II класса – это бокс с рабочим проемом, через который оператор может проводить манипуляции внутри бокса. Бокс должен быть сконструирован таким образом, чтобы оператор был защищен, риск загрязнения продукта и перекрестного загрязнения был низок, а удаление возникающих загрязнений обеспечивалось с помощью профильтрованного воздушного потока, циркулирующего внутри бокса, а также с помощью фильтрации удаляемого из бокса воздуха.

Другими словами, назначение бокса биологической безопасности II класса состоит в:

физической изоляции (т.е. удержании и контролируемом удалении из рабочей зоны) патогенных биологических агентов (ПБА) и микроорганизмов с целью предотвращения