Методические материалы для врачей и студентов / ПЦР, ИФА и др

Метод полимеразной цепной реакции. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР,

PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – молекулярно-биологический метод исследования, получивший широкое распространение в современных лабораториях и используемый для диагностики инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний, а также для исследования состава условнопатогенной флоры.

В настоящее время ПЦР-диагностика является одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

ПЦР - метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.

Ценность метода заключается в многократном копировании (амплификации) определенных, специфических только для данной мишени участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНКполимеразой. Благодаря этому происходит увеличение концентрации специфических для данной мишени фрагментов ДНК в миллионы раз, что значительно упрощает дальнейший анализ.

Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо наличие в реакционной смеси ряда основных компонентов:

1.Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.

2.Taq-полимераза – термостабильный фермент (максимальная активность фермента проявляется при темп. 70-74ºС (хотя фермент может работать и при более низких температурах). Источник происхождения этого фермента – микроорганизм Thermus aquaticus, время полужизни при 94 С составляет около 45 мин. Taq-полимераза обеспечивает достраивание 3’-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности.

3.Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) – «строительный материал», используемый Taqполимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

4.Буфер – смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающая оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН. Анализируемый образец – это подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, например ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.

В соответствии с этими принципами ПЦР клинического образца включает в себя три основных этапа:

1.Пробоподготовка (выделение ДНК из клинического материала),

2.Циклы амплификации (умножения фрагментов ДНК) и регистрация результатов. В каждом цикле число копий амплифицируемого участка удваивается, за 30-40 циклов происходит накопление коротких специфических фрагментов в количестве, достаточном для их дальнейшего распознавания. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

3.Детекция продуктов амплификации осуществляется по-разному: с помощью электрофореза в агарозном геле, или путем гибридизации со специфическим олигонуклеотидным зондом, или с использованием метода масс-спектрометрии и т. д.

Методом ПЦР проводят диагностику вирусных инфекций, таких

как гепатиты, ВИЧ, коронавирус COVID-19 и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.

ПЦР очень широко используется для обнаружения и идентификации микробных возбудителей, в том числе и пародонтопатогенных микроорганизмов, при этом метод позволяет обнаружить возбудитель в биологическом материале даже тогда, когда другие методы оказываются неэффективными. Диагностическая эффективность ПЦР в этом случае значительно возрастает при ее сочетании с культуральным методом диагностики.

Преимущества ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний перед другими методами исследований:

•возможность обнаружения возбудителя инфекции в любой биологической среде организма, в том числе в материале, полученном при биопсии;

•возможность диагностики инфекционных болезней на самых ранних стадиях заболевания;

•возможность количественной оценки результатов исследований (сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом материале);

•высокая чувствительность метода (для обнаружения бактерий или вирусов достаточно всего 4-5 патогенов).

Иммуноферментный анализ (ИФА) – один из наиболее надежных видов иммунохимического анализа, высокочувствительный, экономически выгодный метод, применяемый для качественного и количественного анализа антител и антигенов. Иммуноферментный анализ, как видно из названия, состоит из двух разных компонентов

– иммунной реакции и ферментативной реакции.

Для выявления образующегося комплекса антигена и антител используют в качестве метки фермент или фермент-зависимое вещество. Метод характеризуется относительной простотой проведения реакции, возможностью приборного учета результатов и автоматизации всех этапов анализа. В основе метода ИФА лежит оценка результатов иммунной реакции антигена с антителом. Полученный комплекс определяется следующим образом: в реакционную смесь вводится коньюгат, который включает ферментную метку, а также добавляют специальный хромогенный субстрат. Фермент, взаимодействуя с субстратом, изменяет его окраску.

Иммунная реакция производит связывание биологических молекул, элементов клетки или микроорганизма, которые собственно и пытаются обнаружить, а ферментная реакция позволяет увидеть и измерить результат иммунологической реакции. То есть иммунная реакция – это часть комплексной методики, которая собственно обнаруживает искомый микроб. А ферментная реакция – это та часть комплексной методики, которая позволяет перевести результат иммунной реакции в форму, видимую глазом, и доступную для измерения рутинными химическими методиками.

Основой проведения любого варианта ИФА служит определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями. Чаще всего аппаратный вариант ИФА воспроизводится как «сэндвич»-метод. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют биологический материал, содержащий анализируемый антиген (микробные молекулы, цитокины, биомаркеры). В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса анализируемый антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченых антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод. Ферментативная реакция (цветная реакция, в которой фермент представлен обычно растительной пероксидазой) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявляемого антигена. Результат оценивается спектрофотометрически.

Существует несколько модификаций метода ИФА:

Гетерогенный (твердофазный) ИФА в микропланшетном формате получил наибольшее распространение в тест-системах для лабораторных исследований. В качестве твердой фазы используется поверхность лунок полистиролового планшета, на которую адсорбированы входящие в состав тест-системы известные антигены или антитела (иммуносорбент). В ходе специфической реакции иммуносорбента с определяемыми в исследуемом образце антителами (АТ) или антигенами (АГ) образуются иммунные комплексы, которые оказываются фиксированными на твердой фазе. Субстанции, не участвующие в реакции, и избыточное количество реагентов удаляются при многократной промывке. По механизму реакции среди гетерогенных методов различают конкурентный и неконкурентный.

Непрямой неконкурентный гетерогенный ИФА представлен несколькими этапами: 1. На твердой поверхности пластиковой лунки сорбирован антиген (АГ). В лунку вносится исследуемый биологический материал, чаще всего сыворотка крови пациента.

2.Исследуемые антитела (АТ) во время инкубации связываются с антигеном, сорбированным на планшете. Несвязавшиеся белки удаляют отмыванием.

3.В лунку вносят конъюгат – то есть АТ с заранее прикрепленным к ним ферментом, например пероксидазой, способные связаться с АТ человека, закрепившимися на иммуносорбенте. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии процесса иммунные комплексы, то конъюгат соединяется с определяемыми антителами во время второй инкубации. Несвязавшийся конъюгат остается в жидкой фазе и удаляется отмыванием.

4. В лунку добавляется субстратно-хромогеный реагент, который под влиянием фермента конъюгата, связавшегося с иммунными комплексами, превращается в окрашенный продукт реакции.

Неконкурентный ИФА «Сэндвич» – разновидность неконкурентного гетерогенного ИФА; метод широко используется для определения АТ и АГ :

1.На твердой поверхности пластиковой лунки сорбированы антитела (АТ). В лунку вносится исследуемый биологический материал, чаще всего сыворотка или плазма крови больного.

2.Исследуемые антигены (АГ) в ходе инкубации связываются с АТ, сорбированными на планшете. Несвязавшиеся компоненты удаляют отмыванием.

3.В лунку вносят конъюгат, который представляет собой антитела, меченые ферментом. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии процесса иммунные комплексы, то конъюгат соединяется с определяемыми антигенами и образуется тройной комплекс – «сэндвич». Несвязавшаяся часть конъюгата остается в жидкой фазе и удаляется отмыванием.

4.В лунку добавляется субстратно-хромогеный реагент, который под влиянием фермента конъюгата превращается в окрашенный продукт реакции.

Количество тестируемых антигенов оценивают по содержанию окрашенного продукта реакции, строят калибровочную зависимость и проводят определение концентрации тестируемых антигенов в образцах пациентов. Концентрация определяемого вещества прямо пропорциональна интенсивности окраски пробы и, следовательно, оптической плотности. По аналогичной схеме работают тест-системы для определения АТ, но в качестве иммуносорбента в них используются АГ, а конъюгат содержит раствор АГ, меченых ферментом.

Как правило, для диагностики инфекций используются два вида серологических реакций: 1. Обнаружение патоген-специфических антител в сыворотке крови обследуемого; 2. Установление родовой и видовой принадлежности микроорганизма или вируса. В этом

случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.

ИФА относится к непрямым методам диагностики, так как с ее помощью можно определить наличие антител к патогенному микроорганизму, а не самого возбудителя. Этот анализ рекомендуется выполнять совместно с ПЦР-диагностикой.

Важность иммуноферментного анализа несомненна: его применяют, если требуется определить стадию развития заболевания, провести мониторинг проведенного курса лечения, оценить ответ организма на лечение либо подобрать оптимальную схему терапии.

К преимуществам ИФА относят следующее:

высокая чувствительность (до 90%), позволяющая обнаружить микроорганизмы даже в том случае, если они присутствуют в минимальных концентрациях;

возможность выявить заболевание еще до проявления симптомов;

скорость проведения анализа и получения результатов;

возможность определить примерный срок заражения, а также тип течения инфекции (острая или хроническая);

выявление с высокой степенью достоверности микроорганизмов, которые невозможно определить путем применения других диагностических методов (посева, микроскопии и т.д.).

При выполнении иммуноферментного анализа выявляют антитела разных типов – иммуноглобулины классов M, A, G (JgM, JgA, JgG). Они появляются в разные промежутки времени.

IgM указывает на то, что инфекция находится на острой стадии развития. Этот иммуноглобулин появляется в крови на 4–5 день после предполагаемого заражения. Если выявляют IgM, то пациент в данный момент является больным.

IgG характеризует хроническую форму инфекционного процесса, а также свидетельствует о наличии стойкого иммунитета к антигену. Выработка этого иммуноглобулина происходит на 20–28 день с момента заражения. IgG может сохраняться в крови долгое время – несколько месяцев и даже лет.

IgA – иммуноглобулины, выявление которых указывает на переход острой формы инфекционного процесса в хроническую. Они вырабатываются на 14–20 день с момента заражения и сохраняются в крови больного около двух месяцев.

Анализ ИФА может демонстрировать разные комбинации этих иммуноглобулинов. В зависимости от сочетания, они указывают на определенный этап в развитии заболевания:

JgM (–), JgG (–), JgA (–). Иммунитет к инфекции отсутствует.

JgM (–), JgG (+), JgA (–). У больного имеется иммунитет, приобретенный после введения вакцины или выполнения прививки.

JgM (+), JgG (–/+), JgA (–/+). У пациента присутствует острая инфекция.

JgM (+), JgG (+), JgA (+). У больного протекает период обострения хронической инфекции.

JgM (–), JgG (+/–), JgA (+/–). У пациента имеется хроническая инфекция.

JgM (–). Пациент был заражен, но сейчас выздоровел.

Вирусы гепатита В (ВГВ), или частицы Дейна, представляют собой сферические образования диаметром 42 нм, состоящие из электронноплотной сердцевины (нуклеокапсид) диаметром 27 нм и внешней оболочки толщиной 7-8 нм. В центре нуклеокапсида находится геном вируса, представленный двунитчатой ДНК.

В составе вируса содержатся 3 антигена, имеющих важнейшее значение для лабораторной диагностики заболевания: HBcAg - ядерный, сердцевинный антиген, имеющий белковую природу; HBеAg - трансформированный HBcAg (антиген инфекциозности); HBsAg - поверхностный (австралийский) антиген, образующий наружную оболочку частицы Дейна.

Решающее значение в диагностике имеют специфические методы лабораторных исследований, основанные на определении в сыворотке крови антигенов вируса гепатита

В(HBsAg, HBeAg) и антител к ним (антиНВс, IgM и IgG, анти-НВе.

Вдиагностике вирусного гепатита В ведущее значение имеет определение комплекса маркеров гепатита.

Поверхностный антиген гепатита В в сыворотке крови. Обнаружение поверхностного антигена (HBsAg) гепатита В подтверждает острое или хроническое инфицирование вирусом гепатита В.

При остром заболевании HBsAg выявляется в сыворотке крови в последние 1-2 нед инкубационного периода и в первые 2-3 нед клинического периода. Циркуляция HBsAg в крови может ограничиваться несколькими днями, поэтому следует стремиться к раннему первичному обследованию больных. Частота выявления HBsAg зависит от чувствительности используемого метода исследования. Метод ИФА позволяет выявить HBsAg более чем у 90% больных. Почти у 5% больных самые чувствительные методы исследования не обнаруживают HBsAg, в таких случаях этиология вирусного гепатита В подтверждается наличием анти-HBсAg IgM.

При остром течении гепатита В концентрация HBsAg в крови постепенно снижается вплоть до полного исчезновения антигена. HBsAg исчезает у большинства больных в течение 3 мес от начала острой инфекции. Снижение концентрации HBsAg более чем на 50% к концу 3-й нед острого периода, как правило, свидетельствует о близком завершении инфекционного процесса. Обычно у больных с высокой концентрацией HBsAg в разгар болезни он обнаруживается в крови в течение нескольких месяцев. У больных с низкой концентрацией HBsAg исчезает значительно раньше (иногда через несколько дней после начала заболевания). В целом срок обнаружения HBsAg колеблется от нескольких дней до 4-5 мес. Максимальный срок обнаружения HBsAg при гладком течении острого гепатита В не превышает 6 мес от начала заболевания.

HBsAg может быть обнаружен у практически здоровых людей, как правило, при профилактических или случайных исследованиях. В таких случаях исследуют другие маркеры вирусного гепатита В- анти-HBсAg IgM, анти-HBс IgG, анти-HBеAg и изучают функцию печени. При отрицательных результатах необходимы повторные исследования на HBsAg. Если повторные исследования крови в течение более 3 мес выявляют HBsAg, такого человека относят к хроническим носителям поверхностного антигена. Носительство HBsAg - довольно распространенное явление. В мире насчитывается более 300 млн носителей, у нас в стране - около 10 млн. Прекращение циркуляции HbsAg с последующей сероконверсией (появление антител к HbsAg) всегда свидетельствует о санации организма.

Антитела к HBsAg (анти-HBsAg) гепатита В в сыворотке крови. Антитела к поверхностному антигену гепатита В - анти-HBsAg - обнаруживаются в конце острого вирусного гепатита В или, чаще всего, через 3 мес от начала инфекции, изредка позже (до года) и сохраняются долго, в среднем 5 лет. Анти-HBsAg обнаруживаются не сразу после исчезновения HBsAg. Продолжительность фазы окна варьирует от нескольких недель до нескольких месяцев. Антитела к поверхностному антигену гепатита В нейтрализуют вирус и рассматриваются как признак иммунитета. Они относятся к IgG. Определение анти-HBsAg - надежный критерий развития постинфекционного иммунитета и выздоровления. Выявление анти-HBsAg может служить критерием ретроспективной диагностики гепатита ранее не уточненной этиологии. Анти-HBsAg свидетельствуют о ранее перенесенной инфекции.

Выявление антител к HBsAg играет важную роль в определении контингента для вакцинации против гепатита В. Согласно рекомендациям ВОЗ, если уровень анти-HBsAg составляет менее 10 мМЕ/л, то таким лицам показана вакцинация против гепатита В, при

уровне 10-100 мМЕ/л вакцинация должна быть отложена на 1 год, при уровне более 100 мМЕ/л вакцинация показана через 5-7 лет.

Общие антитела к ядерному антигену гепатита В (анти-HBcAg) в сыворотке крови. Антиген HBcAg обнаруживается только в ядрах гепатоцитов. В крови в свободном виде HBcAg не выявляется. Антитела к ядерному антигену гепатита В появляются первыми среди других антител, связанных с гепатитом В в сыворотке крови больных острым и хроническим вирусным гепатитом В, а также у реконвалесцентов (выздоравливающих). Общие антитела к ядерному антигену гепатита В состоят из иммуноглобулинов классов М и G. Определение общих антител к ядерному антигену гепатита В может использоваться только для ретроспективной диагностики гепатита В, так как у 5-10% больных исследования на HBsAg дают отрицательный результат. Для того, чтобы установить, в какой стадии развития находится гепатит В, необходимо дополнительное определение антител IgM. Антитела IgM - маркер активной репликации вируса, т.е. острой инфекции, а антитела IgG - перенесенной инфекции.

Антитела IgM к ядерному антигену гепатита В (анти-HBcAg IgM) в сыворотке крови. Анти-HBcAg IgM обнаруживаются уже в начале острой фазы болезни, еще до появления или в первые дни желтухи, иногда даже в конце инкубации. Выявление антиHBcAg IgM является убедительным критерием диагностики гепатита В, особенно при отрицательных результатах исследования на HBsAg. Анти-HBcAg IgM циркулируют в крови больных в течение нескольких месяцев (2-5 мес) до периода реконвалесценции, а затем исчезают, что рассматривается как признак очищения организма от вируса гепатита В.

Антитела IgG к ядерному антигену гепатита В (анти-HBcAg-IgG) в сыворотке крови. У больных анти-HBcAg-IgG появляются в острый период вирусного гепатита В и сохраняются на протяжении всей жизни. Анти-HBcAg-IgG - ведущий маркер перенесенного гепатита В.

HBe-антиген (HBeAg) гепатита В в сыворотке крови. HBeAg можно обнаружить в сыворотке крови большинства больных острым вирусным гепатитом В. Он обычно исчезает из крови раньше НВs-антигена. Высокий уровень HBeAg в первые недели заболевания или обнаружение его на протяжении более 8 нед дает основание заподозрить хроническую инфекцию. Этот антиген часто обнаруживается при хроническом активном гепатите вирусной этиологии. Наличие HBeAg в крови свидетельствует о присутствии в организме обследуемого активной инфекции гепатита В и обнаруживается только в случае присутствия в крови HBs-антигена. Наличие НВе антигена свидетельствует о продолжающейся репликации вируса и инфекциозности больного. HBeAg-антиген-маркер острой фазы и репликации ВГВ.

Антитела к HBeAg гепатита В (анти-HBeAg) в сыворотке крови. Появление анти-HBeAg антител указывает обычно на интенсивное выведение из организма ВГВ и незначительное инфицирование больного. Эти антитела появляются в острый период заболевания и сохраняются до 5 лет после перенесенной инфекции. При хроническом персистирующем гепатите анти-HBeAg обнаруживаются в крови больного вместе с HBsAg.

Периоды обнаружения в крови маркеров вирусного гепатита В при остром процессе:

• поверхностный HBs-антиген обнаруживается с инкубационного периода до периода ранней реконвалесценции (5,5-6 мес);

•антиген Hbe обнаруживается в инкубационный и продромальный периоды (до 3,5 мес); его обнаружение свидетельствует о репликации вируса;

•антитела к Hbe-антигену появляются в острый период заболевания 2-4-й мес) и сохраняются до нескольких лет;

•антитела IgM к ядерному антигену (анти-HbcAg-IgM) появляются в продромальном периоде и сохраняются до периода реконвαлесценции (со 2-го по 6-й мес заболевания);

•антитела IgG к ядерному антигену (анти-HbcAg-IgG) появляются в продромальном периоде и сохраняются на протяжении всей жизни (ведущий маркер вирусного гепатита В);

•антитела к поверхностному Hbs-антигену (анти-HBsAg) появляются в стадии поздней реконвалесценции (6-й мес) и сохраняются до 5 лет.

ПЦР позволяет определять в исследуемом материале (кровь, пунктат печени) ДНК ВГВ как качественно, так и количественно. Качественное определение ВГВ в материале позволяет подтвердить наличие вируса в организме больного и тем самым установить причину заболевания. Количественный метод определения содержания ДНК ВГВ дает важную информацию об интенсивности развития заболевания, эффективности лечения и развитии резистентности (устойчивости) к противовирусным препаратам. Проведение ПЦР при ВГВ необходимо для суждения о вирусной репликации. Вирусную ДНК в сыворотке крови обнаруживают у 50% больных при отсутствии HBeAg. Материалом для выявления ДНК ВГВ могут служить сыворотка крови, лимфоциты, гепатобиоптаты.

Обнаружение ДНК ВГВ в материале с помощью ПЦР необходимо для:

•разрешения сомнительных результатов серологических исследований;

•выявления острой стадии заболевания для дифференцировки от ранее перенесенной инфекции или контакта;

•контроля эффективности противовирусного лечения.

Вирус гепатита С (ВГС) относится к семейству флавивирусов. Имеет диаметр от 22 до 60 нм, обнаруживается как в крови, так и в экстрактах печени человека. В отличие от других вирусов гепатита находится в сыворотке крови больных в чрезвычайно низкой концентрации, а иммунный ответ в виде специфических антител очень слабый и поздний.

Диагноз гепатита С устанавливают при обнаружении в сыворотке крови методом ИФА специфических антител к структурным и неструктурным белкам вируса, а также РНК вируса методом ПЦР.

Диагностика гепатита С основана на обнаружении суммарных антител к ВГС методом ИФА, которые появляются в первые 2 нед заболевания и свидетельствуют о возможной инфицированности вирусом или перенесенной инфекции. Анти-ВГС-антитела могут сохраняться в крови реконвалесцентов на протяжении 8-10 лет с постепенным снижением их концентрации. Возможно позднее обнаружение антител спустя год и более после инфицирования.

При хроническом гепатите С антитела определяются постоянно и в более высоких титрах. Большинство используемых в настоящее время тест-систем для диагностики вирусного гепатита С основаны на определении антител класса IgG. Тест-системы, способные определять антитела IgM, позволяют верифицировать активную инфекцию.

Антитела IgM могут выявляться не только при остром, но и при хроническом вирусном гепатите С. Снижение их уровня в процессе лечения больных хроническим гепатитом С может свидетельствовать об эффективности лекарственной терапии.

Обнаружение суммарных антител IgG к ВГС методом ИФА недостаточно для постановки диагноза вирусного гепатита С и требует подтверждения способом иммуноблотинга для исключения ложноположительного результата исследования в динамике.

Метод иммуноблотинга Western-blot - встречная преципитация в геле антител в сыворотке крови больного с различными вирусными белками, подвергнутыми разделению по молекулярной массе с помощью электрофореза и нанесенными на нитроцеллюлозу. Исследование считается положительным, если выявляются антитела к 2 или более белкам ВГС интенсивностью +1. Специфичными для ВГС являются антитела к белкам соге, NS1,

NS2, NS3, NS4, NS5.

Иммуноблотинг на ВГС служит подтверждающим тестом специфичности результата определения антител методом ИФА.

Результаты серологических исследований совместно с клинико-эпидемиологическими данными позволяют установить диагноз и стадию заболевания.

В отличие от серологических методов диагностики вирусного гепатита С, где с их помощью обнаруживают антитела к ВГС, ПЦР позволяет выявить наличие непосредственно РНК ВГС и количественно выразить его концентрацию в исследуемом материале.

Тест имеет видовую специфичность и высокую чувствительность - 10 молекул РНК ВГС в исследуемом материале достаточно для его выявления. Обнаружение антител к вирусу гепатита С подтверждает лишь факт инфицирования пациента, но не позволяет судить об активности инфекционного процесса (о репликации вируса) и прогнозе заболевания. Кроме того, антитела к ВГС обнаруживают как в крови больных острым и хроническим гепатитом, так и у тех пациентов, которые болели и выздоровели, а нередко антитела в крови появляются только спустя несколько месяцев после появления клинической картины заболевания, что затрудняет своевременную диагностику.

Обнаружение ВГС в крови с использованием ПЦР - более информативный метод диагностики. Выявление с помощью ПЦР РНК ВГС свидетельствует о виремии, позволяет судить о репликации вируса в организме и является одним из критериев эффективности противовирусной терапии. Обнаружение РНК ВГС с помощью ПЦР на ранних этапах развития вирусной инфекции на фоне полного отсутствия каких-либо серологических маркеров может служить самым ранним свидетельством инфицирования. Однако изолированное выявление РНК ВГС на фоне полного отсутствия каких-либо других серологических маркеров не может полностью исключить ложноположительный результат ПЦР. В таких случаях требуется всесторонняя оценка результатов клинических, биохимических и морфологических исследований и повторное неоднократное подтверждение наличия инфекции методом ПЦР.

Важное значение имеет применение метода ПЦР у больных хроническим вирусным гепатитом С, так как у большинства из них отсутствует корреляция (соответствие) между наличием вирусной репликации и активностью печеночных ферментов. В таких случаях только ПЦР позволяет судить о наличии вирусной репликации, особенно если конечный результат выражается количественно.

В большинстве случаев исчезновение из сыворотки крови РНК ВГС наблюдается позже нормализации активности печеночных ферментов, поэтому нормализация активности ферментов не может служить основанием для прекращения противовирусного лечения.

Обнаружение РНК ВГС в материале с помощью ПЦР используется в целях:

•разрешения сомнительных результатов серологических исследований;

•дифференцировки гепатита С от других форм гепатита;

•выявления острой стадии заболевания по сравнению с ранее перенесенной инфекцией или контактом; определения стадии инфицированности новорожденных от серопозитивных по ВГС матерей;

•контроля эффективности противовирусного лечения.

ВИЧ-инфекция является одним из немногих инфекционных заболеваний человека, диагноз которого может быть окончательно поставлен лишь при его лабораторном подтверждении. Это связано с тем, что другие методы обследования могут дать лишь основания для предположения у обследуемого ВИЧинфекции.

Для диагностики ВИЧ-инфекции лабораторными методами необходимо определить основные специфические показатели (маркеры) – антитела, антигены, РНК/ДНК ВИЧ. Наличие специфических антител к ВИЧ-1,2 и антигена p ВИЧ-1 выявляют методами иммуноферментного анализа (ИФА)/иммунохемилюминесцентного анализа (ИХЛА) и иммунного блоттинга (ИБ), РНК/ДНК ВИЧ определяется методом ПЦР в режиме реального времени.

Методы иммуноферментного анализа (ИФА) широко применяются для скрининга на наличие антител к ВИЧ. Методы ИФА основаны на простой методологии, обладают высокой чувствительностью и подходят для исследования большого числа образцов. Общим свойством всех вариантов ИФА является использование ферментных конъюгатов, связанных со специфическим антителом или антигеном ВИЧ, и субстрата/хромогенов, дающих окраску в реакции, катализируемой связанным ферментным конъюгатом.

Основу иммуноферментного анализа (ИФА) составляет применение иммобилизованных антигенов ВИЧ, к которым присоединяются антитела из образца крови человека, инфицированного ВИЧ. Вирусные антигены иммобилизуют на дне пластиковых планшетов для ИФА анализа. Обычно от качества пластика зависит эффективность иммобилизации антигена, которая влияет на чувствительность ИФА анализа. Другим важным условием является качество применяемого антигена. Часто применяют вирусные лизаты. Однако предпочтительным является использование рекомбинантных вирусных белков, которые позволяют значительно повысить чувствительность и специфичность теста.

Этапы иммуноферментного анализа:

1.96-луночный пластиковый планшет.

2.Иммобилизация вирусного антигена (коммерческие тест-наборы выпускаются с уже иммобилизованными антигенами).

3.Добавление исследуемого образца (сыворотки крови) и связывание противовирусных антител с иммобилизованным антигеном ВИЧ.