На основании дифференцировки лейкоцитов на три популяции такие анализаторы получили название 3 diff.
II класс – высокотехнологичные гематологические анализаторы,
позволяющие проводить развернутый анализ крови, в том числе дифференцировку лейкоцитов на 5 популяций (5 diff) – нейтрофилы,
лимфоциты, эозинофилы, моноциты, базофилы. Обратите внимание на то,
что автоматические гематологические анализаторы I и II классов не могут дифференцировать сегментоядерные гранулоциты от палочкоядерных и более молодых клеток крови. Для такой дифференцировки необходим ручной подсчет мазка крови путем микроскопии.
III класс – сложные аналитические системы, определяющие помимо показателей анализаторов II класса еще и ретикулоциты, а также дополнительные показатели, отличающиеся у приборов различных производителей. Диагностическое значение этих новых лабораторных показателей пока не определено, поэтому в настоящее время они не внесены в номенклатуру клинических лабораторных исследований и используются пока только в научных целях.
Кондуктометрические счетчики.
Технология автоматического подсчета клеток крови была разработана в
1947 году. Апертуро-импедансный метод (метод Культера или кондуктометрический метод) основан на подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клеток через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электродов. Если через узкий канал,
заполненный электропроводящим раствором, проходит клетка крови, то в этот момент сопротивление электрическому току немного возрастает.
Возникает электрический импульс определенной величины, зависящий от объема проходящей через апертуру клетки. Чтобы определить концентрацию
31
клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через апертуру и подсчитать число электрических импульсов, которые при этом генерируются.
Разделение эритроцитов и тромбоцитов в современных анализаторах проводится по измерению амплитуды электрического сигнала. Тромбоциты имеют малый размер и генерируют при прохождении через апертуру электрические импульсы низкой амплитуды, а сравнительно большие клетки
– эритроциты – импульсы высокой амплитуды. Схема определения клеток крови по методу Культера представлена на рисунке 30.
Рис. 30. Принцип кондуктометрического метода Культера.
Специальное электронное устройство – дискриминатор, разделяет импульсы по величине амплитуды строят гистограмму распределения клеток по объему. Выделив на гистограмме зону объемов клеток, соответствующих
32
эритроцитам и просуммировав количество импульсов, получают общее количество прошедших через датчик эритроцитов – RBC (Red Blood Ctlls),
Если при суммировании результатов подсчета эритроцитов количество импульсов умножать на амплитуду импульсов, то получается величина,
отражающая суммарный объем, который занимают эритроциты в объеме крови, величина гематокрита HCT (Hematocrit). Норма гематокрита составляет у взрослых мужчин 39-50%, у женщин 35-47%.
Повышенный гематокрит наблюдается при реактивных и опухолевых эритроцитозах, уменьшении объема циркулирующей плазмы (ожоговая болезнь, дегидратация). Снижение гематокрита может быть при анемиях,
беременности (2 триместр), гипергидратации.
Разделив гематокритную величину на концентрацию эритроцитов
(RBC), получается полезная для диагностики анемий характеристика эритроцитов - средний объем эритроцитов MCV (mean corpuscular volume).
Показатель MCV используется для разделения анемий на микроцитарные,
нормоцитарные и макроцитарные. Норма MCV у взрослых составляет 80-100
фл.
Аналогичные показатели можно получить и для тромбоцитов, если подсчитать клетки с размером до 30 фемтолитров: концентрация
тромбоцитов – PLT (platelet), тромбокрит – PCT (platelet crit – доля объема тромбоцитов в общем объеме крови в процентах), средний объем тромбоцитов MPV (mean platelet volume).
В норме тромбокрит составляет 0,15-0,4%. PCT является чувствительным показателем для оценки риска возникновения кровотечений.
Снижение параметра PCT ниже 0,1% коррелирует с возникновением послеоперационных кровотечений у пациентов с развивающейся тромбоцитопенией. Повышение PCT указывает на повышенный риск тромбозов.
MPV (mean platelet volume) – средний объем тромбоцитов. Варьирует от 6 до 12 фл и имеет тенденцию к увеличению с возрастом. «Молодые»
33
кровяные пластинки имеют больший объем, поэтому при ускорении тромбоцитопоэза средний объем тромбоцитов возрастает. Увеличение MPV
наблюдается при идиопатической тромбоцитопенической пурпуре,
гипертиреозе, атеросклерозе, сахарном диабете, у курильщиков и лиц,
страдающих алкоголизмом, детей с врожденными пороками сердца «синего типа». Крупные тромбоциты с аномальной морфологией появляются при миелопролиферативных заболеваниях. Уменьшение этого показателя отмечается после спленэктомии, рецидиве болезни Крона и неспецифическом язвенном колите.
У некоторых пациентов в крови присутствуют антитела к тромбоцитам,
активирующиеся под действием этилендиаминтетраацетата (ЭДТА),
используемого в качестве антикоагулянта при взятии крови на общий анализ.
В этом случае в пробирке после взятия крови возникает агрегация тромбоцитов между собой и количество подсчитанных на гематологическом анализаторе тромбоцитов будет существенно занижено. При этом непосредственно в кровеносном сосуде агрегации не происходит и количество тромбоцитов остается нормальным. Поэтому при низких значениях тромбоцитов необходимо обязательно проведение микроскопии мазка периферической крови и при выявлении агрегатов тромбоцитов проводить их подсчет из крови, взятой в пробирку с другим антикоагулянтом.
Поскольку размеры лейкоцитов близки к размеру эритроцитов, их не удается напрямую разделить кондуктометрическим методом. Для подсчета лейкоцитов необходимо разрушить эритроциты. Оказалось, что свойства мембран эритроцитов и лейкоцитов существенно различаются. Эритроциты легко лизируются под действием многих поверхностно-активных веществ,
при этом лейкоциты незначительно изменяются, но остаются целыми.
Поэтому при подсчете лейкоцитов – WBC (White Blood Cells), прежде чем пропустить разведенную суспензию крови через апертуру датчика, к ней добавляют лизирующий раствор, разрушающий эритроциты до очень мелких
34
фрагментов, не влияющих на определение лейкоцитов. Норма содержания лейкоцитов в периферической крови у взрослых составляет 4-9 х 109/л.
Для частичной дифференцировки лейкоцитов на три популяции (3 diff)
необходимо подобрать такую композицию растворителя и гемолитика, что различные формы лейкоцитов претерпевают изменения размеров в разной степени, благодаря чему могут разделяться кондуктометрическим методом.
Область малых объемов (35-90 фл) формируется лимфоцитами, которые под действием гемолитика значительно уменьшаются в объеме. Нейтрофилы под действием гемолитика увеличиваются в объеме и расположены в области больших объемов (120-400 фл). Между двумя пиками имеется зона «средних клеток» (90-120 фл), куда попадают моноциты, базофилы и эозинофилы, а
также плазматические клетки.
Для более точной дифференцировки лейкоцитов (5-diff) используются различные технологии, как правило запатентованные производителями анализаторов. В этих технологиях используется измерение лазерного светорассеяния под разными углами, химический лизис определенных видов клеток, определение внутриклеточных ферментов, определение количества РНК и ДНК. Благодаря этим технологиям удается разделить лейкоциты на 5
популяций: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты, лимфоциты.
Для измерения гемоглобина HGB (hemoglobin) используется фотометрия того же раствора, что и для измерения лейкоцитов. Гемоглобин измеряется в граммах на литр крови. Некоторые анализаторы производства США используют единицу измерения грамм на децилитр. В этих случаях вместо среднего значения гемоглобина 140 г/л прибор выдаст значение 14
г/дл. Норма содержания гемоглобина в крови взрослых составляет у мужчин
132-173 г/л, у женщин 117-155 г/л.
По данным концентрации гемоглобина, количества эритроцитов и значения гематокрита все гематологические анализаторы рассчитывают два индекса «красной» крови. Первый показатель – среднее содержание гемоглобина в эритроцитах MCH (mean corpuscular hemoglobin).
35
Выражается в пикограммах. Характеризует среднее содержание гемоглобина в отдельном эритроците в абсолютных единицах – пикограммах на один эритроцит. Нормальные значения – 27-33 пг. Изменение MCH лежит в основе разделения анемий на нормохромные, гипохромные и гиперхромные.
Показатель MCH зависит от объема эритроцита и при гиперхромных макроцитарных анемиях не отражает насыщение эритроцитов гемоглобином.
Снижение MCH наблюдается при анемиях, обусловленных нарушением синтеза гемоглобина (железодефицитные анемии, порфирии),
повышение - при макроцитарных и особенно мегалобластных анемиях.
Показатель MCH является современным вариантом устаревшего цветового показателя, выражающего относительное содержание гемоглобина в одном эритроците, выраженное во внесистемных единицах. Нормальные значения цветового показателя составляют 0,8-1,05 ед. Такая внесистемная мера традиционно сложилась во время применения единиц Сали для измерения гемоглобина крови на гемометрах, в которых гемоглобин определялся визуально путем сравнения окраски раствора с цветом окрашенного эталона, использовавшимся до широкого внедрения в лабораторную практику фотометрических методов измерения гемоглобина. В
настоящее время, когда лаборатории, благодаря компьютеризации подсчёта и измерения эритроцитов, выдают данные о среднем объёме эритроцита и средней концентрации гемоглобина в эритроците, цветовой показатель
потерял практическое значение.
Вторым расчетным показателем «красной» крови является средняя концентрация гемоглобина на литр эритроцитов MCHC (mean corpuscular hemoglobin concentration). Нормальные значения 320-370 г/л эритроцитов.
Различия между MCH и MCHC заключается в том, что MCH указывает на
массу гемоглобина в одном эритроците и |
выражается в |
долях грамма |
||
(пикограммах). MCHC показывает концентрацию гемоглобина в |
||||
эритроцитах, |
что показывает соотношение содержания гемоглобина к объему |
|||
эритроцитов, |
соответственно |
отражает |
насыщение |
эритроцитов |
|
|
36 |
|
|
гемоглобином. Снижение значения MCHC наблюдается при заболеваниях,
сопровождающихся нарушением синтеза гемоглобина.
Превышение значения MCHC выше 380 г/л эритроцитов в нормальных условиях невозможно, так как превышение концентрации гемоглобина выше этого значения приводит к разрушению (гемолизу) эритроцитов. Поскольку параметр MCHC является расчетным, то превышение значения выше 380 г/л
скорее всего является следствием ошибочного определения значений других параметров. Завысить значение MCHC может ложное завышение гемоглобина, чаще всего при липемии (увеличении количества жиров к крови), а также при занижении гематокрита, что бывает при частичном разрушении эритроцитов в пробе крови. При некоторых состояниях возможно повышение MCHC выше 380 г/л. Такое возможно в физиологических условиях у новорожденных в первые дни жизни вследствие наличия в крови большого количества фетального гемоглобина,
кристаллизующегося в эритроцитах с последующим их разрушением при значительно более высоких концентрациях. Патологические случаи с истинным превышением MCHC выше 380 г/л возможны при талассемии вследствие мутации гемоглобина и соответственно наличии большого количества фетального гемоглобина у взрослого.
Возможной причиной значительного увеличения MCHC может быть холодовая агглютинация эритроцитов, возникающая при наличии в крови пациента антител к эритроцитам, активирующимся при снижении температуры ниже 35 градусов. В этом случае в пробирке после взятия крови эритроциты склеиваются и образуют крупные агрегаты, имеющие размер более 400 фл. Такие агрегаты не входят в подсчет числа эритроцитов, и
соответственно все вошедшие в агрегат эритроциты не подсчитываются.
Возникает ложное занижение числа эритроцитов, и соответственно гематокрита. MCHC при этом существенно увеличивается, так как показатель MCHC определяется отношением концентрации гемоглобина в величине гематокрита. Для правильного определения количества
37
эритроцитов необходимо прогреть пробирку с кровью при 37 градусах и повторить исследование.
Для диагностики анемий используют показатель гетерогенности эритроцитов по объему RDW (red cell distribution width) – показатель анизоцитоза. Показатель может вычисляться как коэффициент вариации объема эритроцитов и в этом случае выражается в процентах стандартного отклонения объема эритроцитов от их среднего объема. Этот показатель в анализаторах обозначается как RDW-CV, норма показателя 11-15%. Другим вариантом расчета показателя является RDW-SD - разница в объеме между самыми большими и самыми маленькими эритроцитами и выражается в фемтолитрах, представляет собой прямое измерение ширины эритроцитарной гистограммы на уровне 20% от базовой линии по оси Y, если высоту пика принять за 100%. Нормы показателя от 35 до 47 фл. Клинически значимое значение, характеризующее анизоцитоз, для RDW-SD составляет более 60 фл. Методы расчета показателя RDW представлены на рисунках 31
и 32.
Рис. 31. Расчет показателя RDW-CV.
38
Рис. 32. Расчет показателя RDW-SD.
PDW (platelet distribution with) – ширина распределения
тромбоцитов по объему. Отражает гетерогенность популяции тромбоцитов по размерам (анизоцитоз тромбоцитов). Измеряется аналогично RDW-CV.
Увеличение PDW одновременно со снижением MPV свидетельствует о преобладании микротромбоцитов и указывает на угнетение тромбоцитопоэза. Сочетание повышенного PDW с увеличением MPV
отражает нарастание числа макротромбоцитов – усиление продукции или потребления тромбоцитов. Увеличение PDW отмечается при развитии деструктивной тромбоцитопении (идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура), а также возможно при миелопролиферативных заболеваниях.
Уменьшение PDW отмечается при железодефицитной анемии.
Гистограмма – это графическое распределение различных видов клеток по их количеству и объему. Для построения гистограмм гематологические анализаторы подсчитывают очень большое количество клеток в одном образце, сортируют импульсы по амплитуде и распределяют частицы объемом от 1 до 256 фл по 256 каналам, каждый из которых соответствует определенному объему частиц.
Для оценки воспалительного процесса используется показатель
скорости оседания эритроцитов СОЭ, ESR (Erythrocyte Sedimentation Rate).
39
Это неспецифический лабораторный показатель крови, отражающий соотношение фракций белков плазмы; изменение СОЭ может служить косвенным признаком текущего воспалительного или иного патологического процесса. Также этот показатель известен под названием «Реакция оседания эритроцитов», РОЭ.
Проба основывается на способности эритроцитов (в лишённой возможности свёртывания крови) оседать под действием гравитации. В
норме величина СОЭ по микрометоду Панченкова у женщин находится в пределах 2—20 мм/час, а у мужчин — 1—10 мм/час.
Принцип метода. Плотность эритроцитов превышает плотность плазмы, поэтому они медленно оседают на дно пробирки. Скорость, с
которой происходит оседание эритроцитов, в основном определяется степенью их агрегации, то есть способностью слипаться вместе (не путать с агглютинацией). Из-за того, что при образовании агрегатов уменьшается отношение площади поверхности частиц к их объёму, сопротивление агрегатов эритроцитов трению оказывается меньше, чем суммарное сопротивление отдельных эритроцитов, поэтому скорость их оседания увеличивается.
Поверхность эритроцитов обладает отрицательным зарядом, который препятствует агрегации из-за возникающих при сближении сил кулоновского отталкивания. Агрегация эритроцитов главным образом зависит от величины их поверхностного потенциала и белкового состава плазмы крови. Степень агрегации (а значит и СОЭ) повышается при увеличении концентрации в плазме т. н. белков острой фазы — маркеров воспалительного процесса. В
первую очередь — фибриногена и иммуноглобулинов, в меньшей степени C-
реактивного белка, церулоплазмина и других.
Хотя воспаление и является наиболее частой причиной ускорения оседания эритроцитов, увеличение СОЭ также может обусловливаться и другими, в том числе и не всегда патологическими, состояниями. СОЭ также может увеличиваться при злокачественных новообразованиях, при
40