Методические материалы для врачей и студентов / Наследственные зб

АЛГОРИТМ РАЗБОРА ТЕОРЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ПО ТЕМЕ ПРАКТИЧЕСКОГО ЗАНЯТИЯ:

«Диагностика наследственных заболеваний обмена веществ»

1.Классификация наследственных заболеваний

2.Пренатальная диагностика наследственных болезней

3.Неонатальный скрининг наследственных заболеваний

4.Клиническая характеристика некоторых генных болезней, их диагностика и

лечение

Наследственные болезни – болезни, обусловленные повреждением наследственного аппарата клетки. Повреждения могут затрагивать весь геном, отдельные хромосомы и вызывать хромосомные болезни или отдельные гены и быть причиной генных болезней. Повреждения генома разной степени встречаются примерно у 1,5% всех новорожденных и вносят существенный вклад в показатели перинатальной патологии, ранней инвалидизации и смертности.

1. Классификация наследственных болезней

1)Моногенные менделирующие заболевания. Они выявляются у 2,5% населения Земного шара, и их частота составляет от 1:500 до 1:50000 новорожденных. Наиболее распространенные моногенные болезни представлены в таблице 1.

Таблица 1. Моногенные болезни.

3)Мультифакториальные или многофакторные болезни, их проявление зависит от наличия мутаций в соответствующих генах и от провоцирующего действия внешней среды. К этим болезням можно отнести: диабет, бронхиальную астму, шизофрению, эпилепсию, ишемическую болезнь сердца, атеросклероз и эссенциальную гипертензию и т.д.

4)Моногенные болезни с нетрадиционным типом наследования, отличающимся от менделевского (например, митохондриальные болезни).

2. Пренатальная диагностика наследственных болезней

Пренатальная диагностика (ПД) наследственных заболеваний - вид обследования, который позволяет обнаружить наследственные заболеваний плода в период беременности матери. Проведение ПД назначается в следующих случаях:

−Наличие у родителей родственников с генетическими заболеваниями.

−Возраст матери старше 35 лет.

−Выявленное генетическое отклонение у одного из родителей, обусловленное полом.

−Выявленная гетерозиготность по ряду заболеваний одного из родителей.

−Выкидыши в анамнезе по неустановленным причинам.

2.1.Основные подходы и методы пренатальной диагностики

Методы ПД могут быть прямыми, когда исследуется сам плод, либо непрямыми, когда объектом исследования является беременная женщина. В свою очередь, прямые методы подразделяются на неинвазивные и инвазивные.

1)Непрямые (обследование беременной): клиническое (акушерско-гинекологическое), медикогенетическое, генеалогическое, цитогенетическое, молекулярно-биологическое, биохимическое (α- фетопротеин, хорионический гонадотропин, эстриол и другие).

2)Прямые (обследование плода): неинвазивные (УЗИ) и инвазивные: получение плодного материала: хорионбиопсия (I триместр), плацентобиопсия (II триместр), амниоцентез: ранний (13-14н. б.); обычный (15-22 н. б.), кордоцентез (II – III триместр), фетоскопия (II – III триместр).

Биохимический скрининг (БС) беременных является общепринятым методом отбора группы женщин с высоким риском ВПР плода. Суть метода заключается в исследовании отклонений сывороточных маркеров от нормы при хромосомной патологии плода.

Внастоящее время принято использовать для скрининга два интервала:

вI триместре – 9-13 нед. беременности – отбирается группапациенток высокого риска рождения детей

схромосомными аномалиями (ХА),

во II триместре – 15-18 нед. – с ХА и некоторыми пороками развития (дефекты заращения нервной трубки открытого типа).

В I триместре беременности показана более высокая эффективность выявления трисомии 21 (от 82 до 94 %). При положительном результатебиохимического скрининга беременной рекомендуется консультация генетика с целью направления на инвазивную пренатальную диагностику. Диагностика подразумевает получение и лабораторный анализ плодного материала (ворсин хориона/плаценты, клеток плода из амниотической жидкости или лимфоцитов пуповинной крови) для исключения наиболее распространенных трисомий в клетках плода или полного анализа его кариотипа.

К маркерным белкам в крови матери относятся а-фетопротеин (АФП), хорионический гонадотропин (ХГЧ) и его свободная β-субъединица (свободный β-ХГЧ), свободный (неконъюгированный) эстриол (НЭ), плазменный ассоциированный с беременностью белок А (ПАББ-А, англ. РАРР-А), ингибин А (ингА) и некоторые другие.

Все эти белки являются эмбрионспецифичными, т.е. продуцируются клетками самого плода или плаценты и поступают в кровоток матери. Их концентрация в сыворотке крови меняется в зависимости от срока беременности и от состояния плода.

Биохимический скрининг беременных на содержание АФП в сыворотке крови направлен на выявление женщин группы высокого риска по наличию открытых дефектов заращения нервной трубки у плода. Повышенное содержание АФП обнаружено у беременных не только с ВПР,но и с многоплодной беременностью, при внутриутробной гибели плода и т.д. Сниженный уровень АФП является маркером повышенного риска рождения ребенка с синдромом Дауна (СД).

Определение содержания одного маркера малоинформативно – только около 30 % плодов с СД войдет в группу высокого риска, поэтому параллельно определяют уровень других эмбрионоспецифичных белков - хорионического гонадотропина (ХГ) или его свободной β-субъединицы (свободный β-ХГ), свободного (неконъюгированного) эстриола (НЭ) и ингибина А (ингА). Уровень маркеров определяют в 9-13 нед. беременности.

В I триместре беременности наибольшие отклонения при ХА у плода наблюдаются в содержании плазменного ассоциированного с беременностью белка А (ПАББ-А) и свободного β-ХГЧ в крови матери. ПАББ-А является протеазой, расщепляющей белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста 1 (ИПФР1). Низкий уровень ПАББ-А – маркер, который свидетельствует о риске рождения ребенка с СД.

Следует иметь в виду, что самой распространенной причиной положительных результатов скрининга

является неверное определение срока беременности, поэтому при несоответствии уровня белка норме необходимо, в первую очередь,уточнить срок беременности с помощью УЗИ.

2.1.1. Цитогенетический метод пренатальной диагностики

Цитогенетическое исследование - исследование структуры хромосом под микроскопом на предмет патологий. Цитогенетическое исследование проводится всем беременным женщинам старше 35 лет, а также будущим мамам, попадающим в зону риска по наследственным заболеваниям.

Для проведения скрининг-диагностики наследственных заболеваний цитогенетическим методом у пациента берут кровь, которая проходит предварительную подготовку. Цитогенетический анализ включает три основных этапа:

1.Культивирование клеток.

2.Окраска препарата.

3.Микроскопический анализ препарата.

2.2.Основные принципы и методы ДНК-диагностики генных болезней

ДНК-диагностика может проводиться на любой стадии онтогенеза, в том числе до рождения, и материалом для анализа могут быть любые клетки и ткани плода.

Основные виды пренатальной ДНК-диагностики генных болезней:

1) Прямая диагностика, в основе - идентификация мутаций в самом гене.

Преимущества метода: высокая точность диагностики, возможность ПД, анализа информативности (пригодности для молекулярной диагностики) семьи и выявления гетерозиготных носителей при отсутствии больного ребенка.

2) Косвенная диагностика, в основе - маркирование мутантного гена (маркирование хромосомы, несущей мутантный ген) с помощью молекулярных маркеров. Условием проведения косвенной ДНКдиагностики является наличие в семье больного ребенка или возможность исследования его ДНК.

2.2.1. Методы анализа генетического полиморфизма

Условно можно выделить шесть групп методов анализа генетического полиморфизма: 1.Ферментативные подходы: полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP), полиморфизм

длин аплифицированных фрагментов (AFLP), расщепление эндонуклеазой Clevase I (CFLP), расщепление резолвазой (EMD), анализы, основанные на лигазной реакции (LDR, LCR, Padlock), инвазивное расщепление олигонуклеотидов (Invader), случайная амплификация полиморфной ДНК (RAPD, AP-PCR), ПЦР с прямой терминацией синтеза (DT-PCR), аллель-специфический ПЦР (AS-PCR).

2.Химические методы: химическое расщепление гетеродуплексов, химическое лигирование. 3.Методы, основанные на различной электрофоретической подвижности полиморфных участков ДНК:

анализ конформации одноцепочечных фрагментов (SSCP), гетеродуплексный анализ, секвенирование ДНК. 4.Детекция на твердой фазе: гибридизация на олигонуклеотидных матрицах, оптиковолоконный ДНК-

гибридизационный анализ, элонгация иммобилизованных праймеров (минисеквенирование) пиросиквенс. 5.Хроматографические методы: денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматогра

фия (ВЭЖХ).

6.Физические методы: масс-спектрометрия, резонансное тушение флуоресценции (FRET), люминесценция, зависящая от локального окружения.

Секвенирование, т.е. «чтение» генетического кода всего клеточного генома является «золотым стандартом» выявления любых мутаций на уровне всего генома, индивидуальных хромосом и отдельных генов. Была разработана технология выделения из генома человека только той ее части, котораянеобходима для синтеза белков, так называемого экзона, на долю которого приходится всего около 2% ДНК клетки. Секвенирование экзонов занимает всего несколько часов и уже используется для широкомасштабного (полногеномного) поиска мутаций, лежащих в основе редких заболеваний. В настоящее время идентифицированы сотни генов, мутации которых приводят к различным моногенным заболеваниям. Для многих из них уже созданы базы данных и банки мутаций, идентифицированы мажорные, т.е. наиболее часто встречающиеся мутации, выявлены участки повышенной мутабельности («горячие точки»), разработаны алгоритмы молекулярной диагностики. В случае наиболее частых наследственных болезней (муковисцидоз, фенилкетонурия, миодистрофия Дюшена, серповидно-клеточнаяанемия и др.) созданы коммерческие наборы, позволяющие выявлять в автоматическом режиме сразу несколько диагностически наиболее важных мутаций.

2.2.2. Новые направления пренатальной ДНК-диагностики

1)Доимплантационная диагностика (ДД) появилась благодаря развитию методов вспомогательной

репродукции и методов, приемлемых для анализа генома единичных клеток, таких как методы молекулярной цитогенетики (различные варианты FISН) и молекулярной генетики (варианты ПЦР). Список заболеваний, доступных для этого вида диагностики в настоящее время, насчитывает более 30 нозологий и включает все наиболее частые моногенные и хромосомные болезни.

Материалом для ДД являются полярные тельца (преконцепционная диагностика) или отдельные бластомеры дробящейся яйцеклетки или клетки трофобласта (собственно доимплантационная диагностика). Основная проблема – большая вероятность неточного прогноза о генотипе ооцита при тестировании только первого полярного тельца, в котором высока возможность (50%) кроссинговера. Уточнить наличие мутации можно только после завершения второго деления мейоза, т.е. по второму полярному тельцу, которое образуется уже после оплодотворения яйцеклетки. Вторая проблема обусловлена особенностями применения молекулярно-генетических методов для исследования ДНК единичной клетки. На результаты ПЦР могут повлиять различные факторы, в частности контаминация образца или условия проведения реакции.

Применение преконцепционной диагностики наследственных болезней пока весьма ограничено. Сложности работы с единичными клетками, необходимость наличия первоклассного современного оборудования и высококвалифицированных специалистов существенно лимитируют широкое внедрение этой технологии.

Диагностика с использованием изолированных бластомеров позволяет получить точную информацию о генотипе эмбриона. Биопсия 1-2 бластомеров осуществляется на стадии 8-10 клеток. Поскольку на ранних стадиях дробления все бластомеры тотипотентны, удаление нескольких клеток не сказывается на дальнейшем развитии эмбриона. Методически анализ единичных бластомеров от дробящихся зародышей не отличается от анализа полярных телец.

Выбор метода молекулярной диагностики определяется спецификой исследуемой мутации и включает как метод ПЦР, так и более сложные ДНК-методы. Они позволяют проводить диагностику всех наиболее распространенных моногенных болезней – аутосомно-рецессивных (муковисцидоз, β-талассемия, спинальная амиотрофия Верднига-Гоффмана, болезнь Тея-Сакса), аутосомно-доминантных (миотоническая дистрофия, синдром Марфана, хорея Гентингтона), Х-сцепленных (миодистрофия Дюшенна и синдром ломкой Х-хромосомы).

Основное преимущество ДД заключаетсяв возможности трансплантации генетически полноценных эмбрионов, т.е. в возможности начать беременность заведомо здоровым плодом. Недостатками этогоподхода являются ограничения, обусловленные достаточно жесткими временными рамками, а также методические трудности, связанные с необходимостью работы с микроколичествами материала.

2) Пренатальная диагностика по клеткам и нуклеиновым кислотам плода в крови матери

Несмотря на значительный прогресс в области пренатальной диагностики, все инвазивные процедуры остаются связанными с определенным риском прерывания беременности вследствие процедуры.

Неинвазивный подход в ПД наследственных заболеваний связан с исследованием клеток, ДНК или РНК плода, находящихсяво время беременности в периферической крови матери вследствие их трансплацентарной трансфузии. Современная техника выделения клеток плода из крови матери включает методы проточной цитофотометрии, магнитной активации и градиентного центрифугирования.

Более перспективным на сегодняшний день представляется подход, основанный на анализе ДНК и РНК плода в крови матери. Показано, что ДНК из клеток плода (плаценты, плодных оболочек) попадает в плазму материнской крови и может быть обнаружена при помощи молекулярно-генетических методов. В настоящее время в ряде передовых лабораторий и центров по пренатальной диагностике успешно разрабатываются высокочувствительные методы неинвазивной диагностики пола плода и его резус-принадлежности, начиная с 7-й недели беременности. Однако надежность этого метода остается под вопросом.

3. Неонатальный скрининг наследственных заболеваний

Массовое обследование новорожденных на наследственные болезни обмена (неонатальный скрининг) позволяет диагностировать заболевания на доклинической (досимптоматической) стадии, позволяет определить гетерозиготное носительство мутантного гена и сформировать контингенты, требующие систематического медико-генетического консультирования и проведения пренатальной диагностики.

Рис.3. Алгоритм неонатального скрининга наследственных заболеваний

Массовые скринирующие обследования помогают получить наиболее достоверные данные о частоте возникновения наследственных заболеваний в отдельных популяциях, что дает возможность планировать объем медицинской помощи больным и соответственно общие затраты, необходимые для профилактики заболевания в регионе.

4. Клиническая характеристика некоторых генных болезней и их диагностика

Причиной генных болезней являются мутации – изменения в структуре ДНК самих генов или в их регуляторных областях, приводящие к нарушениям их функции и, как следствие, к появлению аномальных продуктов или к полной блокаде их синтеза.

Мутации на уровне нуклеотидов в виде замен, делеций, дупликаций, инсерций одного или нескольких нуклеотидов – наиболее обширная группа мутационных повреждений, широко представленная практически во всех изученных генах наследственных болезней.

Моногенных болезней с наличием четко определяемых, доминирующих по частоте мажорных мутаций, важных для ДНК-диагностики, сравнительно немного.

Клинические проявления одного и того же заболевания у разных больных могут различаться. Это объясняется генетической гетерогенностью наследственной патологии, которая может быть обусловлена разными мутациями в одном гене (аллельная гетерогенность), либо мутациями в разных генах (локусная гетерогенность).

Аллельная гетерогенность обусловлена тем, что разные мутации одного гена по-разному влияют на его экспрессию. Например, мутации в гене CFTR приводят к нарушению транспорта хлора. Мутации типа нонсенс, сдвиг рамки считывания, сплайсинговые мутации приводят к возникновению блока синтеза полноразмерного белка, транспортирующего хлор. В этом случае велика тяжесть клинических проявлений муковисцидоза, которые сопровождаются поражением поджелудочной железы. Мутации типа миссенс приводят к нарушению процессинга белка, к нарушению функции белка и к ограничению трансмембранного переноса хлора. Такие нарушения у больных дают мягкую клиническую картину муковисцидоза, у них отсутствует поражение поджелудочной железы. При сочетании в компаунде миссенс и нонсенс мутаций проявляется умеренная форма муковисцидоза, при этом у больных мужчин наблюдаются нарушения сперматогенеза, обусловленные двусторонним недоразвитием семявыносящих протоков.

Таким образом, клинические проявления мутации гена CFTR существенно зависят от природы мутаций и от того, как мутация проявляется в белковом продукте или его функциональной активности. Для других генов справедливы те же закономерности.

4.1.Муковисцидоз

Муковисцидоз (кистозный фиброз поджелудочной железы) – одно из самых распространенных моногенных наследственных заболеваний у представителей белой расы. Белковый продукт генатрансмембранный регуляторный белок муковисцидоза (cystiс fibrosis transmembrane regulator – CFTR) является хлорным каналом в апикальных мембранах эпителиальных клеток, через который осуществляется активный транспорт ионов хлора. Ген расположен в середине длинного плеча 7 аутосомы, содержит 27 экзонов и охватывает 250 000 пар нуклеотидов.

В гене CFTR идентифицированы более 900 точечных мутаций, несколько делеций и дупликаций. Наиболее распространенной является мутация delF508, приводящая к отсутствию фенилаланина в 508-м положении белка CFTR. Мутации гена CFTR нарушают не только транспорт, но и секрецию ионов хлора. При затруднении их прохождения через клеточную мембрану увеличивается реабсорбция натрия железистыми клетками, нарушается электрический потенциал просвета, что вызывает изменение электролитного состава и дегидратацию секрета желез внешней секреции. В результате выделяемый секрет становится чрезмерно густым и вязким. При этом страдают легкие, желудочно-кишечный тракт, печень, поджелудочная железа, мочеполовая система, часто встречается остеопороз. Прогрессирование легочной и сердечной недостаточности является наиболее частой причиной смерти пациентов (95%). Продолжительность жизни больных муковисцидозом составляет 25-30 лет.

Муковисцидоз может быть заподозрен по следующим признакам: наличие внутриутробно по данным УЗИ – гиперэхогенного кишечника, в периоде новорожденности затяжная неонатальная желтуха, витамин К-зависимые геморрагические состояния, мекониевый илеус (является форма врожденной непроходимости кишечника, обусловленная закупоркой его просвета вязким густым меконием).

Неонатальный скрининг включает следующие этапы:

1)Определение концентрации иммунореактивного трипсина (ИРТ) в высушенном пятне крови. Это чувствительный (85-90%), но не специфичный признак. Гипертрипсинемия может быть при перинатальном стрессе, коньюгационной желтухе новорожденных, трисомиях хромосом 13 и 18, врожденной инфекции, почечной недостаточности,атрезии тонкой кишки. При положительном результате (концентрация ИРТ более 70 нг/мл) проводят повторное определение ИРТ в образцах крови, собранной на 21-28 день жизни. Для этого возраста пороговым считают содержание ИРТ в сухом пятне крови около 40 нг/мл. При положительном результате ребенку проводят потовую пробу.

2) Потовый тест - определение концентрации электролитов в потовой жидкости. Стандартная методика потового теста предусматривает проведение пилокарпинового электрофореза с последующим определением концентрации электролитов в потовой жидкости. Для электрофореза используют 0,07% раствор пилокарпина. С помощью слабого электрического тока (от 1,5-2,0 до4-6 мА, в зависимости от размеров электродов) препарат вводят в кожу в течение 10 мин, стимулируя потовые железы. В течение поледующих 30 мин пот собирают на беззольный фильтр. Собранный пот взвешивают и определяют концентрацию электролитов в нем.

Более точными способами диагностики МВ признаны экспресс-методы проведения потового теста основанные на анализе проводимости пота (непрямое определение концентрации хлоридов).

У большинства здоровых детей концентрация натрия и хлора в потовой жидкости не превышает 40 ммоль/л. При показателе в 40-60 ммоль/л потовую пробу следует повторить. Следует помнить,что, хотя потовая проба – высокоспецифичный тест диагностики МВ, крайне редко возникают состояния, сопровождающиеся повышением содержания хлоридов в потовой жидкости (СПИД, недостаточность надпочечников, атопический дерматит и др.).

Положительный результат потовой пробы (содержание электролитов в потовой жидкости более 60 ммоль/л) служит подтверждением диагноза. Ребенка направляют в специализированный центр МВ для клинического обследования, консультирования и наблюдения.

При пограничном (40-60 ммоль/л) и положительном результатах проводят ДНК-диагностику. Стратегия молекулярно-генетической диагностики МВ включает несколько этапов.

1)поиск вариантов, наиболее частых в популяции, к которой принадлежит обследуемый.

2)расширенный поиск более редких вариантов, используя секвенирование по Сэнгеру или высокопроизводительное секвенирование генома (MPS/NGS). Анализ включает исследование всей кодирующей последовательности гена CFTR (27 экзонов), областей экзон-интронных соединений, 5'-

и3'-некодирующих областей (до 200-300 нуклеотидов) и глубоких интронных областей, где расположены варианты с доказанной патогенностью.

3)сканирующими методами, в том числе секвенированием, можно выявить нарушения последовательности гена, незначительные по протяженности: нуклеотидные замены, небольшие делеции/инсерции. Рекомендуется использовать следующие технологии: MLPA – мультиплексную лигазную зондовую амплификацию либо QFMP – количественную флуоресцентную мультиплексную ПЦР.

Диагноз считают доказанным, если удается идентифицировать мутации в гене CFTR. Если их не удается обнаружить, то диагноз МВ не исключают из-за возможности редкой мутации.

На заключительном этапе выполняют медико-генетическое консультирование семьи.

Всем пациентам с установленным диагнозом МВ рекомендовано проведение развернутого общего (клинического) анализа крови с целью ориентировочной оценки воспалительного процесса, контроля влияния на показатели крови проводимой терапии и в комплексной оценке нутритивного статуса (ежеквартально). Рекомендовано проведение общего (клинического) анализа мочи с целью своевременного выявления поражения почек (1-2 раза в год), а также определение активности панкреатической эластазы в кале (ежегодно), микробиологическое исследование мокроты (1 раз в 3 мес). При необходимости исследования

проводят чаще.

Всем пациентам с МВ рекомендовано проведение общетерапевтического биохимического анализа крови (общий белок, альбумин, определение активности в крови АСАТ, АЛАТ, гамма-глютамилтрансферазы, щелочной фосфатазы, амилазы, липазы, исследование уровня холестерина и триглицеридов, натрия, калия, хлоридов, исследование уровня общего, свободного и связанного билирубина, исследование уровня C- реактивного белка), ежегодно, по показаниям – чаще. Исследование проводится с целью контроля состояния печени, функции поджелудочной железы, электролитного обмена и хронического воспаления согласно показаниям. Рекомендовано исследование уровня глюкозы в крови всем пациентам с МВ 1 раз в 6 мес. с целью контроля эндокринной функции поджелудочной железы. Рекомендовано определение уровня общего и ионизированного кальция, фосфора крови, креатинина сыворотки крови и клиренса креатинина.

Обязательные составляющие лечения: диетотерапия, заместительная терапия недостаточности экзокринной функции поджелудочной железы, муколитическая терапия, дренирование бронхиального дерева, лечебная физкультура, антибактериальная терапия, витаминотерапия, терапия осложнений.

4.2.Фенилкетонурия

Фенилкетонурия (ФКУ) – одно из наиболее частых аутосомно-рецессивных заболеваний, объединяющее несколько генетически гетерогенных форм нарушения обмена фенилаланина, сходных по клиническим признакам.

Классическая фенилкетонурия (фенилкетонурия I типа) обусловлена дефицитом фермента фенилаланингидроксилазы (ФАГ), что ведет к накоплению фенилаланина и продуктов его распада в биологических жидкостях. Заболевание вызвано мутацией гена фенилаланингидроксилазы (РАН), локализующегося на длинном плече хромосомы 12, участке 12q22q24.1. К настоящему времени выявлено более 500 различных мутаций в гене РАН. Наиболее распространенным типом мутаций являются однонуклеотидные замены – миссенс-мутации (60%), второе место по частоте занимают различные делеции

(13,5%).

Фенилкетонурия II типа обусловлена дефицитом дигидроптеридинредуктазы (DHPR), вследствие которого развиваются метаболические блоки на путях превращения фенилаланина в тирозин, а такжеобразования предшественников нейромедиаторов катехоламинового и серотонинового ряда L-дофы и 5-окситриптофана. Заболевание вызвано мутацией гена цитозольной дигидроптеридинредуктазы QDPR. Ген QDPR локализован на хромосоме 4p15.3.

Фенилкетонурия III типа связана с недостаточностью 6- пирувоилтетрагидроптеринсинтазы (PTPS), участвующей в процессе синтеза тетрагидробиоптерина из дигидронеоптерин трифосфата. Заболевание вызвано мутацией структурного гена для цитозольной 6-пирувоилтетрагидроптерин синтазы PTS, что приводит к ее недостаточности впечени и эритроцитах. Ген PTS расположен на длинном плече хромосомы 11в районе q22.3-23.3.

Патогенез заболевания связан с нарушением обмена фенилаланина. В результате метаболического блока превращения фенилаланина в тирозин происходит значительное накопление фенилаланина и его токсических метаболитов (фенилпировиноградной, фенилмолочной, фенилуксусной кислот, фенилэтиламина и др.) в биологических жидкостях больного организма, что оказывает токсическое действие на ЦНС.

Транзиторная форма гиперфенилаланинемии (ГФА) в период новорожденности - временное повышение уровня ФА в крови ребенка, в большинстве случаев обусловленноенезрелостью ферментативных систем новорожденного, например, при глубокой недоношенности или функциональной незрелости. Впоследствии биохимические показатели нормализуются. Клинические проявления либо отсутствуют, либо незначительны.

Все формы ГФА можно диагностировать уже в первые дни жизни ребенка, когда клинические проявления еще отсутствуют. Для этого проводят биохимический скрининг новорожденных на наличие гиперфенилаланинемии.

Биологическим материалом для исследования служат высушенные пятна капиллярной крови новорожденных на фильтровальной бумаге. Главным критерием диагностики ГФА является повышенное содержание фенилаланина в крови, нормальный уровень которого в крови у здоровых людей составляет 0-2 мг/дл.

В родильном доме у всех новорожденных на 4-й день жизни (у недоношенных на 7-й день) берется кровь из пятки на тест-бланки, которые доставляются в лабораторию медико-генетической консультации, осуществляющей определение содержания ФА в крови.

Значение фенилаланина выше 2,0 мг/дл классифицируется как ГФА, которая требует проведения уточняющей диагностики. Это более сложная процедура, иногда многоэтапная. Во-первых, необходимо подтвердить гиперфенилаланинемию и, во-вторых, установить ее причину. ГФА может быть обусловлена классической (типичной) ФКУ, связанной с недостаточностью фенилаланингидроксилазы, птеринзависимыми (кофакторными) формами болезни, резистентными к диетотерапии, наследственной

гиперфенилаланинемией (доброкачественной ГФА), другими формами нарушения метаболизма (тирозинемия, галактоземия и др.).

На уточняющем этапе проводится повторное обследование всех детей с первичной гиперфенилаланинемией. При содержании ФА в крови от 2,1 до 8,0 мг/дл предполагается доброкачественная ГФА. Ребенок наблюдается в медико-генетической консультации в течение первого года жизни с ежемесячным контролем уровня ФА крови.

При концентрации ФА в крови выше 8,0 мг/дл диагностируется фенилкетонурия, назначается диетотерапия, на основании эффективности которой планируются мероприятия по уточнению диагноза и выбору дальнейшей тактики необходимого лечения.

Для исключения птерин-зависимых форм ФКУ во многих развитых странах у лиц с гиперфенилаланинемией исследуются птерины в моче. В РФ при подозрении на данные формы диагноз подтверждается молекулярногенетическим методом.

Следует отметить, что при определенных мутациях в гене РАН при введении кофактора BH 4 активность фермента ФАГ восстанавливается, в таком случае соблюдение диеты не требуется или диета расширяется с увеличением в рационе белковых продуктов. При подозрении на BH4чувствительную форму в ряде стран проводится нагрузка с ВН4 при употреблении белковых продуктов под контролем уровня фенилаланина в крови. Отсутствие нарастания уровня ФА в крови позволяет подтвердить данную форму патологии.

Рис. 4. Алгоритм неонатального скрининга на фенилкетонурию

В медицинской практике используется как прямая диагностика мутаций в гене ФАГ, так и косвенная –

с использованием различных полиморфных маркеров. С помощьюсинтетических олигонуклеотидных зондов проводится прямой поиск наиболее часто встречающихся мутаций гена РАН. Если исследуемые мутации не выявлены, рекомендуется секвенирование гена РАН.

В случае невозможности получения прямых генетических данных о гене РАН методом секвенирования, используется более доступное косвенное подтверждение наследования мутантного локуса РАН в одной или двух копиях, идентифицируемое по ПДРФ (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) или VNTR (вариабельные по количеству тандемные повторы) в ДНК пробанда и его родителей. Данный метод позволяет выявить не саму мутацию, а факт передачи потомству хромосомы, несущей полиморфный маркер, тесно связанный с мутантным геном.

В настоящее время известно более 600 мутаций в гене РАН, спектр и распространенность которых имеет межпопуляционные и этнические особенности. Для жителей Европы, в т.ч. для РФ, мажорной в гене РАН является мутация R408W, в то время как в Японии и Китае данная мутация ненайдена. Во многих европейских популяциях с относительно высокой частотой регистрируются следующие мутации: IVS12nt1, R261Q, R252W, R158Q, P281L, IVS10nt546, I65T.

Большинство генетических изменений гена PAH – это миссенс-мутации,но с сайтами сплайсинга, нонсенс-мутации и мутации в неструктурных генах; могут происходить и сдвиги рамки и более крупные удаления и вставки. Разные мутации влияют на работу фермента PAH в различной степени – этим может объясняться большое разнообразие уровня ФА в крови больных ФКУ. Местоположение и вид мутаций

неэффективно, в связи с чем основной метод лечения – диетотерапия,основанная на резком ограничении фенилаланина в рационе больных детей за счет исключения высокобелковых продуктов. Недостающее количество белкавосполняется за счет специализированных лечебных продуктов, частично или полностью лишенных фенилаланина. Выбор тактики лечения детей с ГФА зависит от первичного биохимического нарушения. Для каждой формысуществуют свои особенности диетотерапии. Необходимо учитывать, что эффективность лечения зависит от времени его начала. Диетотерапия должна быть начата не позднее первых недель жизни ребенка. Рацион больного ФКУ строят по принципу резкого ограничения фенилаланина, поступающего с пищей.

Убольных ФКУ старше 18 лет возможно смягчение диетических ограничений за счет включения

врацион некоторых количеств круп, кисломолочных и ряда других продуктов, белок которых не содержит высокихконцентраций ФА. Такие диетические «послабления» должны проходить на фоне регулярного контроля уровня ФА в крови и при сохранении использования в диете высокобелкового продукта без ФА на основе смеси аминокислот в количестве не менее 50% от суточного белкового эквивалента.

Прогноз состояния и уровня психического развития больных зависит отмногих факторов: формы заболевания и связанной с ней тяжести энзимного дефекта, сроков начала и адекватности специализированного лечения.

4.3. Миодистрофия Дюшенна-Беккера

Миодистрофия Дюшенна-Беккера – сцепленная с полом мышечная дистрофия. Выделяют две клинические формы заболевания: тяжелую – миодистрофию Дюшенна (МДД) и более мягкую – миодистрофию Беккера (МДБ).Ген миодистрофии Дюшенна-Беккера - самый крупный из известных генов человека, картирован на коротком плече Х-хромосомы. Ген МДД/Б кодирует белок дистрофин, входящий в состав сарколеммы мышечного волокна. При МДД дистрофин либо полностью отсутствует, либо деградирует вскоре после синтеза. При МДБ, как правило, дистрофин присутствует, хотя и в измененном, чаще всего укороченном варианте. Нарушения стабильности и проницаемости мембран сопровождается физическим разрывам мембран и вытеканием содержимого мышечного волокна с его последующей дегенерацией. Миопатия Дюшена приводит к постепенной атрофии мышц поясов конечностей и дыхательных мышц. Заболевание имеет инвалидизирующее течение.

Разработаны эффективные методы диагностики делеции в гене дистрофина, основанные на мультиплексной ПЦР. Одновременное тестирование 18 экзонов промоторной части гена позволяет выявить до 98 % всех крупных делеций гена. При отсутствии идентифицируемой делеции применяют косвенные методы ДНК-диагностики.

В гене DMD выявляют две «горячие точки»: первая находится в интроне между 7 и 8 экзонами, а вторая - в интроне между 44 и 45 экзонами. В этих точках наиболее часто происходят мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания или к остановке синтеза белка. Генетическое возмущение гена DMD связано с транпозоноподобными ALU-элементами, которые располагаются внутри этого гена. В 70% семейных

случаев миопатии Дюшена у больных выявляются мутации в левой «горячей точки»,а в 30% изолированных случаев мутации de novo обнаруживаются в правой «горячей точке».

Ген DMD имеет восемь независимых промоторов, которые осуществляют альтернативную транскрипцию в разных тканях. В результате альтернативной транскрипции образуются несколько изоформ дистрофина - полноразмерных или укороченных.

Мутации, приводящие к образованию небольшого количества дистрофина, обладающего остаточной активностью, описаны при миопатии Беккера, имеющей мягкое течение.

Таким образом, миопатия Дюшена и миопатия Беккра являются разными клиническими вариантами различных мутационных повреждений одного гена, которые называют аллельной гетерогенностью.

4.4. Спинальная мышечная атрофия (СМА)

Спинальная мышечная атрофия (СМА) – аутосомно-рецессивное заболевание, характеризуется поражением моторных нейронов передних рогов спинного мозга, в результате чего развиваются симметричные параличи конечностей и мышц туловища. Это наиболее частое летальное моногенное заболевание, второе после муковисцидоза.

У подавляющего большинства пациентов со СМА основным типом мутаций являются делеции в гене SMN1, кодирующем белок, участвующий в синтезе сплайсосомы. Наличие мажорной мутации (делеции 7-8- го экзонов гена SMN1) позволяет проводить прямую молекулярную ДНК-диагностику у большинства больных СМА. Основная сложность в проведении подобного исследования заключается в существовании высокогомологичной копии гена SMN1-гена SMN2. Больные СМА нуждаются в специальном диетическом питении, поддерживающей терапии. На настоящий момент разработаны препараты генной терапии этой группы заболеваний.

4.5. Галактоземия

Галактоземия (ГАЛ) – группа наследственных нарушений обмена углеводов, при которых в организме накапливается избыток галактозы и ее метаболитов, что обусловливает клиническую картину заболевания и формирование отсроченных осложнений. Тип наследования всех форм галактоземии – аутосомнорецессивный (1:20000).

Галактоземия тип I (ГАЛ I) обусловлена мутациями в гене GALT, картированном на 9p13.3, что приводит к дефициту галактозо-1- фосфатуридилтрансферазы (ГАЛТ).

Галактоземия тип II (ГАЛ II) обусловлена мутациями в гене GALK1, картированном на 17q25.1, что приводит к дефициту галактокиназы (ГАЛК).

Галактоземия тип III (ГАЛ III) обусловлена мутациями в гене GALE, картированном на 1р36.11, что приводит к дефициту УДФ-галактозо-4-эпимеразы.

ГАЛ I (OMIM 230400) проявляется в неонатальном периоде. На фоне вскармливания молоком или молочной смесью, содержащей лактозу и галактозу у новорожденного появляется рвота, диарея, мышечная гипотония, сонливость, вялость. Отсутствует прибавка вмассе тела, наблюдаются вялое сосание, отказ от груди матери, появляются и нарастают признаки поражения печени, часто сопровождающиеся гепатомегалией/гепатоспленомегалий, желтухой, гипогликемией, нередко отмечается кровоточивость из мест инъекций. С первых месяцев жизни у многих детей формируется двояковыпуклая катаракта.

Наиболее тяжелым проявлением ГАЛ I у новорожденных является сепсис, который имеет фатальное течение и чаще всего обусловлен грамотрицательными микроорганизмами, в 90% случаев – Escherichia coli. Как осложнения сепсиса, возможно развитие менингита, остеомиелита.

Клиническая симптоматика при ГАЛ II (MIM 230200) у многих больных может быть ограничена только формированием катаракты, остальные симптомы заболевания незначительно выражены.

Галактоземия III типа (MIM 230350) встречается исключительно редко, частота ее точно неизвестна. Выделяют 2 клинические формы ГАЛ III, связанные с недостаточностью ГАЛЭ: доброкачественную (изолированную) и тяжелую (генерализованную). Клинические проявления при доброкачественной форме могут отсутствовать, и заболевание выявляется случайно при обнаружении повышенного уровня галактозы в крови.

В результате недостаточности любого из трех ферментов – ГАЛТ, ГАЛК или ГАЛЭ – в крови повышается концентрация галактозы. При снижении активности ферментов ГАЛТ и ГАЛЭ, помимо избытка галактозы, в организме пациента накапливается также избыточное количество галактозо-1- фосфата, что на сегодняшний день считается основным патогенетическим фактором, обусловливающим большинство клинических проявлений ГАЛ и формирование отсроченных осложнений. Избыток галактозы в организме может метаболизироваться в других биохимических путях: она может превращаться в галактитол. Накопление галактитола в крови и тканях и повышение его экскреции с мочой наблюдается при всех формах ГАЛ; в хрусталике глаза избыток галактитола способствует формированию катаракты. Имеются сведения о том, что высокое содержание галактитола в тканях мозга способствует набуханию