Методические материалы для врачей и студентов / КЛД Занятие
.pdf4. Добавление проявляющих антител, конъюгированных с ферментом, по активности которого можно судить о реакции и наличии антител в исследуемом образце.
5.Оценка цветовой реакции и постановка диагноза.
ВИФА принято определять противовирусные антитела класса IgG, которые присоединяются к иммобилизованному на дне планшета вирусному антигену и тем самым «вылавливаются» из крови ВИЧ-инфицированного. Эти антитела затем обнаруживаются при помощи уже других антител, конъюгированных с ферментом со специальным красителем. Это так называемые проявляющие антитела, поскольку по их содержанию и количеству судят о наличии ВИЧ-инфекции. О присоединении этих проявляющих антител к противовирусным IgG антителам судят по активности конъюгированного фермента и на основании цветовой окраски. Положительную реакцию интерпретируют при помощи спектрофотометра (ридера) на основании степени окрашивания в сравнении с отрицательным контролем.
Определение антител к ВИЧ является основным методом лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. В основе метода лежит ИФА (чувствительность более 99,5%, специфичность более 99,8%). Антитела к ВИЧ появляются у 90-95% инфицированных в течение 3 мес после заражения, у 5-9% через 6 мес и у 0,5-1% в более поздние сроки. В стадии СПИДа количество антител может снижаться вплоть до полного исчезновения. При получении положительного ответа-выявлении антител к ВИЧ - во избежание ложноположительных результатов анализ должен быть повторен еще один или два раза, желательно с использованием диагностикума другой серии. Положительным результатом считается, если из двух в обоих или из трех в двух анализах отчетливо выявлены антитела.
Метод ИФА по определению антител к ВИЧ является скрининговым. При получении положительного результата для подтверждения его специфичности используется метод иммуноблотинга Western-blot- встречная преципитация в геле антител в сыворотке крови больного с различными вирусными белками, подвергнутыми разделению по молекулярной массе с помощью электрофореза и нанесенными на нитроцеллюлозу. Определяются антитела к вирусным белкам gp41, gp120, gp160, р24, р18, р17 и др. Обнаружение антител к одному из гликопротеинов - gp41, gp120, gp160 - следует считать положительным результатом. При обнаружении антител к другим белкам вируса результат считается сомнительным, и такого человека следует обследовать еще дважды: через 3 и 6 мес. Отсутствие антител к специфическим белкам ВИЧ означает, что иммуноферментный метод дал ложноположительный результат.
Для определения и количественной оценки РНК вируса ВИЧ применяется принцип полимеразной цепной реакции. Единственным отличием от стандартной ПЦР является использование обратной транскрипции для того, чтобы превратить вирусную РНК в ДНК.
Метод ПЦР для обнаружения РНК ВИЧ может быть качественным и количественным. Качественное обнаружение РНК ВИЧ используют для:
•неонатального скрининга;
•подтверждения результатов скринингового серологического исследования;
•скрининга пациентов с высоким риском наличия ВИЧ-инфекции;
•разрешения сомнительных результатов по иммуноблотинговому исследованию;
•контроля эффективности противовирусного лечения;
•определения стадии заболевания СПИД (переход инфицированности в заболевание).
Прямое количественное определение РНК ВИЧ с помощью ПЦР позволяет более точно, чем определение количества CD4-лимфоцитов, предсказать скорость развития СПИДа у лиц, инфицированных ВИЧ, следовательно, более точно оценить их выживаемость. Высокое содержание вирусных частиц обычно коррелирует с выраженным нарушением иммунного статуса и низким количеством CD4-лимфоцитов. Низкое содержание вирусных частиц обычно коррелирует с более благополучным иммунным статусом и более высоким количеством СD4-лимфоцитов.
При инфекции ВИЧ прогноз непосредственно определяется уровнем виремии. Снижение уровня виремии при лечении улучшает прогноз заболевания.