Методические материалы для врачей и студентов / Гемостаз

«Гемостаз. Методы исследования»

Система гемостаза представляет собой совокупность морфофункциональных и биохимических механизмов, обеспечивающих остановку кровотечения и, вместе с тем, поддерживающих кровь в жидком состоянии внутри сосудов. Можно сказать, что это система поддержания крови в физиологическом агрегатном состоянии.

Основными компонентами системы гемостаза являются сосудистая стенка (особенно ее эндотелиальная выстилка и субэндотелий), клетки крови, а также плазменные и клеточные ферментные системы: свертывающая, фибринолитическая, антикоагулянтная, калликреинкининовая, комплемента. Эти чрезвычайно тесно связанные и взаимозависимые по своим функциональным и регуляторным позициям компоненты.

При повреждении кровеносного сосуда инициируется каскад реакций, в результате которого образуется сгусток крови — тромб, предотвращающий кровотечение. Основную роль в свёртывании (коагуляции) крови играют тромбоциты и ряд белков плазмы крови.

В остановке кровотечения различают 3 этапа.

На первом этапе происходит сокращение кровеносного сосуда.

На втором этапе к месту повреждения прикрепляются тромбоциты, которые, наслаиваясь друг на друга, образуют тромбоцитарную пробку (белый тромб). Белый тромб является непрочным и может закупорить только небольшой кровеносный сосуд.

На третьем этапе растворимый белок плазмы крови фибриноген превращается в нерастворимый белок фибрин, который откладывается между тромбоцитами, и формируется прочный фибриновый тромб. Такой тромб содержит эритроциты и поэтому называется красным тромбом.

Спазм сосудов: в пределах нескольких секунд;

Формирование тромбоцитарного сгустка: от 3 до 5 минут;

Формирование фибринового сгустка: от 10 до 30 минут;

Процессы восстановления, с вовлечением системы фибринолиза: от дней до недель

Формирование тромба — многокомпонентный процесс, состоящий из двух этапов:

первичного — микроциркуляторного или сосудисто-тромбоцитарного и вторичного — макроциркуляторного или плазменно-коагуляционного.

Инициация этих двух этапов начинается одновременно и идет параллельно, но первичный гемостаз завершается быстрее, создавая основу для последующих реакций плазменно-коагуляционного звена.

Первичный гемостаз обеспечивает остановку кровотечения из мелких сосудов за счет обеспечения их спазма, адгезии, агрегации, секреции из тромбоцитов биологически активных веществ с образованием белого тромбоцитарного тромба, его сокращения (ретракции) и уплотнения.

Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз осуществляется на основе взаимодействия тромбоцитов с сосудистой стенкой в местах ее повреждения. Благодаря своим уникальным свойствам неповрежденный эндотелий интактен. Он не смачивается, в нем синтезируются биологически активные вещества, определяющие его общий антитромботический потенциал: дезагрегирующая эндоперекись — простациклин (PgI2), оксид азота (NO), антитромбин III и др.

Простациклин реализует своё действие через аденилатциклазную систему передачи сигнала. Взаимодействие простациклина с рецептором вызывает активацию протеинкиназы А. Активная протеинкиназа А фосфорилирует и таким образом активирует Са2+-АТФ-азу и Са2+-транслоказу. Это приводит к снижению уровня содержания Са2+ в цитоплазме тромбоцитов, сохранению ими дисковидной формы и снижению способности к агрегации.

Так как наружняя сторона эндотелиоцитов и тромбоцитов заряжены отрицательно, то адгезии (прилипания) последних к стенке сосудов

При изменении отрицательного заряда на эндотелии в результате деполяризации мембран эндотелиоцитов, или при их повреждении, создаются условия для усиления адгезии тромбоцитов. При повреждении эндотелия образуется чужеродная «тромбогенная» контактная поверхность, которая активирует тромбоциты и тем самым запускает процесс взаимодействия их со стенкой сосудов.

Тромбоциты — кровяные пластинки — мелкие безъядерные неправильно округлой формы клетки крови. Диаметр их составляет 1-4 мкм, а толщина 0,5-0,75 мкм. Они образуются в костном мозге путем отщепления участков вещества гигантских клеток — мегакариоцитов. Тромбоциты циркулируют в крови в течение 5-11 дней, а затем разрушаются в печени, легких, селезенке.

Кровяные пластинки различаются по форме, в 1 мкл крови их содержится 200-400

тысяч.

Тромбоциты содержат биологически активные вещества (в частности, гистамин и серотонин), ферменты. Выделяют 11 факторов свертывания крови, находящихся в тромбоцитах.

Тромбоцит. Схематическая структура тромбоцита

•Диаметр Тr - 3,1±0,3 мкм;

•Толщина Тr – 1,0±0,2 мкм;

Индукторы активации тромбоцитов in VIVO

- Катехоламины - Кальций

.

тромбоцит осуществляется взаимодействие фибриногеновых гликопротеиновых рецепторов тромбоцитов друг с другом. Благодаря этому феномену кровяные пластинки соединяются (агрегируют). Чем больше рецепторов — тем больше контактов, тем мощнее агрегация.

Мостиком между рецепторами тромбоцитов выполняет фибриноген. Именно в процессе вторичной необратимой агрегации образуется своеобразная гемостатическая пробка, которая вначале отличается малой плотностью и легко проходима для плазмы и форменных элементов крови. Для того, чтобы этого не происходило, существует ретракция

— процесс стягивания тромбоцитарного агрегата в абсолютно непроницаемый конгломерат. По своим функциональным характеристикам такая гемостатическая пробка ничем не отличается от нормальной сосудистой стенки.

Ретракция, как и реакции высвобождения, обеспечивается сократительными элементами тромбоцитов при участии Са2+. Именно последовательное, поэтапное повышение концентрации внутриклеточного ионизированного кальция приводит к развитию функциональной активности тромбоцитов.

Активация тромбоцитов

Взаимодействие c ФВ ведет к активации тромбоцитов:

Изменение формы:

Выброс из гранул тромбоцитов:

Альфа гранулы: фибриноген, фактор V, фактор Виллбранда, PF 4, -TG, …

Плотные гранулы: AДФ (индукция агрегации)

Вскрытые мембранные фосфолипиды, поддерживают процесс коагуляции*

Продукция тромбоксана A2 (TX A2)

*Тромбоцитарный фактор 3, вовлекается в процессы коагуляции

В эту фазу выделяются биологически активные вещества, которые вызывают сужение сосуда, уменьшая размер повреждения, усиливают адгезию и агрегацию тромбоцитов. Образуется первичный рыхлый тромбацитарный тромб (тромбоцитарная «гемостатическая пробка») — рис. 2.

Активированные тромбоциты

Плазменный гемостаз

Плазменный гемостаз представляет собой каскад последовательных превращений, происходящих в плазме крови с участием 13 факторов свертывания (табл. 2). Факторы свертывания согласно международной классификации обозначены римскими цифрами.

Большинство факторов свертывания крови — вещества белковой природы, образующиеся в печени. Их недостаток может быть связан с нарушением функции печени.

1)образование тромбопластина;

2)образование тромбина;

3)образование фибрина.

Первая фаза — образование и высвобождение тромбопластина (тромбокиназы) — весьма активного фермента.

Различают:

-Тканевой (внешний) тромбопластин, выделяющийся из клеток поврежденного сосуда и тканей;

-Кровяной, (внутренний), освобождающийся при разрушении тромбоцитов.

Прокоагулянтный (внешний) путь занимает центральное место в свёртывании крови В циркулирующей крови содержатся проферменты протеолитических ферментов: фактор II (протромбин), фактор VII (проконвертин), фактор IX (Кристмаса), фактор X (Стюарта). Находящиеся в крови факторы Va (акцелерин) и VIIIа (антигемофильный фактор), а также мембранный белок — тканевый фактор (ТФ, фактор III) являются белками-активаторами этих ферментов.

При повреждении сосуда «включается» каскадный механизм активации ферментов с последовательным образованием трёх связанных с фосфолипидами клеточной мембраны ферментных комплексов. Каждый комплекс состоит из протеолитического фермента, белкаактиватора и ионов Са2+: VIIa-TФ-Ca2+, IXa-VIIIa-Ca2+ (теназа), Xa-Va-Ca2+ (протромбиназа). Комплекс Xa-Va-Ca2+ (протромбиназный комплекс) активирует протромбин (фактор II). Каскад ферментативных реакций завершается образованием мономеров фибрина и последующим формированием тромба.

В активации ферментов каскада выделяют три основных механизма:

-частичный протеолиз,

-взаимодействие с белками-активаторами и

-взаимодействие с модифицированными клеточными мембранами.

Активация частичным протеолизом. Все ферменты прокоагулянтного пути являются сериновыми протеазами, синтезируются в печени в виде неактивных проферментов и в такой форме циркулируют в крови. В процессе реализации тромбогенного сигнала проферменты (факторы VII, IX, X и II) частичным протеолизом превращаются в активные ферменты.

Взаимодействие белков-активаторов с протеолитическими ферментами.

Тканевый фактор, фактор Va и фактор VIIIа имеют центры связывания с фосфолипидами мембран и ферментами VIIа, IXa и Ха, соответственно. При связывании с белкамиактиваторами в результате конформационньгх изменений активность этих ферментов повышается.

Взаимодействие ферментных комплексов с клеточными мембранами происходит с участием ионов Са2+. Все проферменты прокоагулянтного пути (II, VII, IX, X) содержат остатки -карбоксиглутаминовой кислоты, образующиеся в результате посттрансляционой модификации этих белков в ЭР гепатоцитов.

Остатки -карбоксиглутаминовой кислоты в факторах VIIa, IXa и Ха обеспечивают взаимодействие этих ферментов посредством Са2+ с отрицательно заряженными фосфолипидами клеточных мембран. В отсутствие ионов Са2+ кровь не свёртывается.

Роль витамина К в карбоксилировании остатков глутаминовой кислоты в проферментах прокоагулянтного пути свёртывания крови. Карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты в проферментах прокоагулянтного пути катализирует карбоксилаза, коферментом которой служит восстановленная форма витамина К (нафтохинона) — дигидрохинон витамина К (рис 3).

Рис. 3. Роль витамина К в посттрансляционном карбюоксилировании глутаминовой кислоты

Недостаточность витамина К приводит к нарушению карбоксилирования проферментов прокоагулянтного пути и сопровождается кровоточивостью, подкожными и внутренними кровоизлияниями.

Структурные аналоги витамина К дикумарол и варфарин ингибируют тиолзависимые ферменты витамин К 2,3-эпоксидредуктазу и витамин К редуктазу, вызывая торможение свёртывания крови. Эти препараты применяют в клинической практике для предупреждения тромбозов.

Инициация каскада реакций прокоагулянтного пути. Ферментные мембранные комплексы прокоагулянтного пути образуются только при наличии на внешней поверхности

плазматической мембраны клеток тканевого фактора и отрицательно заряженных фосфолипидов. Специальная ферментная система обеспечивает трансмембранный перенос и такое распределение фосфолипидов в клеточных мембранах, при котором в норме внешняя поверхность плазматических мембран клеток не заряжена.

При нарушении поперечной асимметрии мембран тромбоцитов и эндотелиальных клеток на их поверхности формируются отрицательно заряженные (тромбогенные) участки и экспонируется апопротеин III тканевого фактора. Такие нарушения могут возникнуть при физической травме.

В этом случае тканевый фактор и внутренняя поверхность клеточной мембраны становятся доступными для плазменных факторов прокоагулянтного пути.

Внешний путь формирования протромбиназы

Активация фактора VII

VIIa

Фосфолипид

Тромбопластин: Тканевой фактор + фосфолипид + Са2+

Adapted from G.J. Brose, Annu. Rev. Med. 1995, 46:103-12

Кроме того, взаимодействие сигнальных молекул, рецепторами эндотелиальных клеток и тромбоцитов регуляторные системы. В конечном итоге это приводит

цитоплазме Са2+, который ингибирует АТФ-зависимую аминофосфолипидтранслоказу. Этот фермент играет важную роль в сохранении поперечной асимметрии мембран.

Активация ферментов каждого комплекса — результат взаимодействия всех его компонентов. Если факторы IX, X и II требуют активации, то фактор VII обладает невысокой протеолитической активностью. Фактор VII мембранного комплекса VII-ТФ-Са2+ частичным протеолизом активирует факторы IX и X. Активные факторы IХа и Ха включаются в