Методические материалы для врачей и студентов / Белки крови
.pdfα1-антитрипсин,
α1-кислый гликопротеин (орозомукоид);
•α1-липопротеин. 2. α2-глобулины:
•α2-макроглобулин;
•гаптоглобин;
•аполипопротеины А, В, С;
•церулоплазмин;
3. β-глобулины:
•трансферрин,
•С3-компонент системы комплемента,
•β- липопротеины;
•гемопексин.
4.γ-глобулины:
• иммуноглобулины – IgA, IgM, IgG
Исследование белковых фракций является более информативным в диагностическом отношении, чем определение только общего белка или альбумина. При многих заболеваниях часто изменяется процентное соотношение белковых фракций, хотя общее содержание белка в сыворотке крови остается в пределах нормы. Анализ электрофореграмм белков позволяет установить, за счет какой фракции у больного имеется увеличение или дефицит белка, а также судить о специфичности изменений, характерных для данной патологии. Однако исследование белковых фракций позволяет судить о характерном для какого-либо заболевания избытке или дефиците белка только в самой общей форме. Наибольшую клиническую информативность для диагностики и дифференциальной диагностики электрофореграмма сыворотки крови имеет при следующих заболеваниях:
•множественная миелома;
•макроглобулинемия Вальдестрема;
•гипогаммаглобулинемия;
•агамма-А-глобулинемия;
•анальбуминемия;
•бисальбуминемия;
•афибиногенемия;
•атрансферинемия;
•нарушение обмена α-антитрипсина;
•цирроз печени.
Выделяют следующие основные типы нарушений протеинограмм:
1.диспротеинемии — изменения в соотношении белковых фракций по сравнению с нормальными значениями;
2.генетические дефекты синтеза белков;
3.парапротеинемии — появление в крови аномальных белков (например, при миеломной болезни).
Диспротеинемии
Диспротеинемия может проявляться различными изменениями в соотношении основных белков сыворотки крови. Рассмотрим их в порядке расположения белковых фракций на электрофореграмме. Изменения фракции α1-глобулинов Увеличение фракции α1-глобулинов наблюдается при острых, подострых, обострении хронических воспалительных процессов; поражении печени; всех процессах тканевого распада или клеточной пролиферации. Снижение фракции α1-глобулинов наблюдается при дефиците α1антитрипсин, гипо-α1-липопротеинемии. Изменения фракции α2-глобулинов Увеличение фракции α2-глобулинов наблюдается при всех видах острых воспалительных процессов, особенно с выраженным экссудативным и гнойным характером (пневмонии, эмпиема плевры, другие виды гнойных процессов); заболеваниях, связанных с вовлечением в патологический процесс соединительной ткани (коллагенозы, аутоиммунные заболевания, ревматические заболевания); злокачественных опухолях; в стадии восстановления после термических ожогов; нефротическом синдроме. Снижение фракции α2-глобулинов наблюдается при сахарном диабете, панкреатитах (иногда), врожденной механической желтухе у новорожденных, токсических гепатитах. К α2-глобулинов относится основная масса белков острой фазы. Поэтому увеличение этой фракции отражает интенсивность стрессорной реакции и воспалительных процессов при перечисленных видах патологии. Изменения фракции β-глобулинов 21 Увеличение фракции β- глобулинов выявляют при первичных и вторичных гиперлипопротеинемиях, заболеваниях печени, нефротическом синдроме, кровоточащей язве желудка,
гипотиреозе. Пониженные величины содержания β-глобулинов выявляют при гипоβлипопротеинемии. Изменения фракции γ-глобулинов Фракция γ- глобулинов содержит иммуноглобулины G, А, М, Д, Е. Поэтому повышение содержания γ-глобулинов отмечается при реакции системы иммунитета, когда происходит выработка антител и аутоантител: при вирусных и бактериальных инфекциях, воспалении, коллагенозе, деструкции тканей и ожогах. Значительная гипергаммаглобулинемия, отражая активность воспалительного процесса, характерна для хронических активных гепатитов и циррозов печени. Повышение фракции γ-глобулинов наблюдается у 88– 92% больных хроническим активным гепатитом, причем значительное повышение (до 26 г/л и выше) у 60–65% больных. Почти такие же изменения отмечаются у больных при высокоактивном циррозе печени, при далеко зашедшем циррозе, при этом нередко содержание γ-глобулинов превышает содержание альбуминов, что выступает плохим прогностическим признаком. Повышение содержания в крови γ-глобулинов, кроме уже названных причин, может сопровождать следующие заболевания: ревматоидный артрит, системную красную волчанку, хронический лимфолейкоз, эндотелиомы, остеосаркомы, кандидомикоз. Уменьшение содержания γ-глобулинов бывает первичным и вторичным. Различают 3 основных вида первичных гипогаммаглобулинемий: физиологическую (у детей в возрасте 3—5 мес), врожденную (генетический дефект синтеза антител) и идиопатическую (когда установить причину не удается). Причинами вторичных гипогаммаглобулинемий могут быть многочисленные заболевания и состояния, приводящие к истощению иммунной системы. Сопоставление направленности изменений содержания альбуминов и глобулинов с изменениями общего содержания белка дает основание для заключения, что гиперпротеинемия чаще связана с гиперглобулинемиями, в то время как гипопротеинемия чаще связана с гипоальбуминемией. Нередко для оценки выраженности диспротеинемии рассчитывают альбумин-глобулиновый коэффициент, т.е. отношение величины фракции альбуминов к величине фракции глобулинов. В норме этот показатель составляет от 2,5 до 3,5. У больных хроническими гепатитами и циррозами печени этот коэффициент понижается до 1,5 и даже до 1 за счет снижения содержания альбумина и повышения фракции глобулинов.
Генетические дефекты синтеза белков
Исследование сыворотки крови на белковые фракции позволяет выявить генетические заболевания, передаваемые по наследству. Одним из проявлений наследственных дефектов выступает нарушение синтеза некоторых белков.
Парапротеинемия
Парапротеинемией называется появление в крови белков, отличающихся в физическом, химическом и иммунологическом отношении от обычных белков сыворотки крови.
Специфические (или индивидуальные) белки
Специфические белки крови выполняют разнообразные функции: осуществляют транспорт различных веществ, участвуют в свертывании крови, ингибируют протеолитические ферменты, активно участвуют в иммунологических реакциях. Помимо выполнения специфических функций, белки крови участвуют в общих реакциях организма при различных патологических процессах, отражая при этом, в определенной степени, состояние органов и тканей, что нашло применение в клинической практике.
Альфа 1-антитрипсин
Альфа-1-кислый гликопротеин (AAG)
Антистрептолизин О
Бета-2-микроглобулин
Гаптоглобин
Преальбумин
Церулоплазмин
Цистатин С
Остеокальцин
Трансферрин
Ферритин
Миоглобин
Тропонин I
Тропонин Т
С-реактивный белок
Принцип метода электрофореза белков.
Для разделения белков сыворотки крови на их составляющие используют метод электрофореза, основанный на различной подвижности белков сыворотки крови в электрическом поле.
Принцип разделения белков сыворотки крови на фракции состоит в том, что в электрическом поле белки сыворотки крови движутся по смоченной буферным раствором хроматографической бумаге (ацетатцеллюлозной пленке, крахмаловому, агаровом гелям) со скоростью, зависящей в основном от величины электрического заряда и молекулярной массы частиц.
Вследствие этого белки сыворотки крови разделяются обычно на пять основных фракций: альбумины, альфа-1-глобулины, альфа-2-глобулины, бетаглобулины, гамма-глобулины, содержание которых определяется с помощью фотометрии или денситометрии.
Электрофорез в агаровом, крахмальном и особенно полиакриламидном геле дает лучшие результаты: четкое разделение и большое количество белковых фракций сыворотки. Недостатки метода: сложность процедуры приготовления геля (дороговизна готовых гелевых пластин).
Преимущества электрофореза на ацетатцеллюлозной пленке:
1.Химическая однородность пленки и одинаковый размер пор
2.Требует малый объем пробы (0,2-2 мкл) для разделения
3.Быстрота разделения и окраски белков, легкость отмывания фона
4.Низкая стоимость
В сыворотке крови здорового человека при электрофорезе можно обнаружить шесть белковых фракций: преальбумины, альбумины, альфа-1-глобулины, альфа-2-глобулины, бета-глобулины и гамма-глобулины.
Это исследование в диагностическом отношении более информативно чем определение только общего белка или альбумина. При многих заболеваниях изменяется процентное соотношение белковых фракций, хотя общее содержание белка в сыворотке крови остается в пределах нормы.
Анализ фореграммы белков позволяет установить, за счет какой фракции происходит увеличение или дефицит белка, а также судить о специфичности изменений, характерных для данной патологии. Исследование белковых фракций, позволяет судить о характерном для какого-либо заболевания избытке или дефиците белка только в самой общей форме.
Белковые фракции сыворотки крови в норме:
Фракции Содержание, % Преальбумины 2-7 Альбумины 52-65 Альфа-1-глобулины 2,5-5,0 Альфа-2-глобулины 7,0-13,0 Бета-глобулины 8,0-14,0 Гамма-глобулины 12,0-22,0
При анализе результатов исследования сыворотки крови на белковые фракции выявляются три типа нарушений:
1.Диспротеинемия (изменение соотношения белковых фракций)
2.Генетические дефекты синтеза белков
3.Парапротеинемия (аномальные белки в крови)
Количественное определение суммы белков сыворотки крови биуретовым (колориметрическим) методом
Принцип метода: метод основан на способности белков, содержащих пептидные связи, образовывать с раствором сульфата меди в щелочной среде комплексное соединение, окрашенное в фиолетовый цвет. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации белка и измеряется колориметрически. Для определения концентрации окрашенных растворов широко используется фотоэлектроколориметр (кфк-3).
Ход работы: в первую пробирку наливают 0,1 мл исследуемой сыворотки, в другую (контрольную) - 0,1 мл 0,9 % раствора хлорида Натрия. В обе пробирки добавляют по 5,0 мл биуретового реактива. Содержимое пробирок смешивают, избегая образования пены. Через 30 минут экстинкцию исследуемых растворов измеряют на кфк-3 в кювете толщиной 1 см против контрольного раствора. Экстинкция (Е) показывает величину абсорбции светового пучка тем или иным раствором и характеризует долю поглощенного света. Построение калибровочного графика и расчет концентрации вещества по найденной экстинкции на примере определения содержания белков в сыворотке крови. Готовят несколько растворов определяемого в биологическом объекте вещества (в нашем случае белка) с различной концентрацией, с учетом изменения его содержания в сторону повышения или снижения при патологических состояниях. Так, например, в норме количество белка в сыворотке крови колеблется в пределах 65-85 г/л. Для построения
графика Готовят растворы, содержащие 40, 60, 80, 100 г/л альбумина. Из каждой пробирки берут по 0,1 мл раствора и добавляют к нему 5,0 мл биуретового реактива. Через 30 минут измеряют экстинкцию на кфк-3. Строят график, на оси абсцисс откладывая концентрации растворов, а на оси ординат - соответствующие им значения экстинкции. Это позволяет в Дальнейшем, определив экстинкцию исследуемого раствора, найти по графику, какой концентрации она соответствует.
