Цель работы: изучить клетки с помощью цитофотометрических методов.
Ход работы.
Теоретическая часть
Введение
Оптические методы, которые применяются для изучения клетки, объединяются термином «цитофотометрия». Они учитывают особенности химической и структурной организации объекта измерения. В клетках оптическими центрами поглощения служат входящие в них различные молекулы или их комплексы. Область поглощения этих оптических центров определяется рядом факторов: химическим строением поглощающих молекул, их состоянием – адсорбированы ли они, растворены или находятся в конденсированном состоянии.
Цитофотометрия - оптические методы, которые применяются для изучения клетки.
В клетках оптическими центрами поглощения служат входящие в них различные молекулы или их комплексы. Область поглощения этих оптических центров определяется химическим строением поглощающих молекул, их состоянием. Поглощающие молекулы вступают во взаимодействие с другими компонентами среды. Изучая спектр поглощения клетки или ее части, можно определить входящие в нее органические структуры и их состояние.
В основе количественной цитофотометрии лежит закон Бугера - Бэра. При значении оптических плотностей от 0,1 до 1,2 точность измерений максимальна.
В цитофотометрии объект исследования отличается неравномерным распределением поглощающего вещества, собранного в гранулы, размер и форма которых широко варьируют. Такое состояние вещества приводит к тому, что световой поток, проходящий через поле фотометрирования, оказывается больше потока, проходящего через равное количество того же вещества, но при идеальном растворении, в результате возникает ошибка распределения.
Клетка как объект фотометрии
В зависимости от спектральной области, в которой производятся измерения, цитофотометрию делят на ультрафиолетовую и видимую.
УФ - цитофотометрия охватывает область спектра 240-320 нм. В этой области поглощают такие важные компоненты клетки, как нуклеиновые кислоты, белки, свободные нуклеотиды, предшественники и продукты распада нуклеиновых кислот, лигнин, витамины, гормоны.
Ультрафиолетовое поглощение белков определяют циклические аминокислоты - тирозин, триптофан и в меньшей степени фенилаланин. В полосу поглощения с максимумом около 280 нм вносит свою долю каждая из аминокислот.
Цитофотометрия в видимой области спектра дает принципиальную возможность специфической метки, а значит, и анализа любого внутриклеточного соединения. Здесь краситель выступает в роли посредника. Чтобы по его содержанию можно было судить о количестве окрашенного вещества, необходимо выполнять следующие условия:
краситель должен быть специфичным, т.е. окрашивать только те соединения, которые подлежат анализу;
концентрация конечного продукта реакции красителя с веществом должна быть пропорциональна концентрации исследуемого соединения, т.е. быть количественной;
окрашенный конечный продукт должен подчиняться закону поглощения.
Кроме того, цитофотометрия в видимой области позволяет анализировать ряд внутриклеточных соединений по их собственному поглощению - гемоглобин, меланин, родопсин, хлорофилл и др.
Способы выражения цитофотометрических данных
В зависимости от соотношения между фотометрируемой площадью и площадью клетки возможны следующие варианты расчета:
1. Фотометрируемая площадь ограничена контуром клетки. Тогда для определения массы достаточно знать величину фотометрируемой площади, которую легко определить из конструктивных параметров прибора.
2. Фотометрируемая площадь меньше клетки, и поэтому определяют только массу М в пределах этой площади. Если средняя оптическая плотность в пределах всей клетки одинакова, то содержание вещества во всей клетке можно найти умножением М на отношение площади всей клетки к площади фотометрируемого участка.
Плаг-метод. Принцип этого метода заключается в представлении клетки в виде кюветы, заполненной поглощающим веществом. Фотометрирующий пучок вырезает в центральной части клетки объем в форме пробки. Для определения массы вещества необходимо знание всего объема клетки. При работе плаг-методом и многоточечным методом измеряют среднюю оптическую плотность на относительно гомогенном участке клетки с последующей экстраполяцией ее на всю площадь.
Одноволновой метод. В этом методе зонд полностью перекрывает клетку. Измерение площадей клеток делать не нужно, однако необходимо максимально уменьшить случайные погрешности измерений, поскольку измеряемые оптические плотности очень малы.
Двухволновой метод. Поглощающее вещество в одной части поля отсутствует, а в другом – распределено равномерно. Под решением будем понимать определение средней оптической плотности клетки, которая служит основанием для расчета вещества.
Материалы и методы
В объектив просматривали предметные стекла с мазками окрашенных эритроцитов. Определение спектра поглощения красителя, выбор длины волны цитофотометрии. Проведение цитофотометрии тремя способами. Оборудование: установка для цитофотометрии, предметные стекла с мазками эритроцитов.