новая папка / Лабораторная диагностика
.docx
Министерство образования и науки Российской федерации
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
«Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого»
Институт медицинского образования
Лечебный факультет
Кафедра акушерства гинекологии и педиатрии
Реферат
по дисциплине «Медицинская генетика» на тему:
«Лабораторная диагностика»
Выполнил:
Проверил:
Доцент
Сеченева Л.В.
Великий Новгород
Введение.
Лабораторная диагностика наследственных болезней может быть направлена на идентификацию одной из трёх ступеней болезни:
Выявление этиологической причины наследственной патологии, т.е определение конкретной мутации индивида. Для этого применяются следующие методы: цитогенетические или молекулярно-генетические методы.
Регистрация первичного продукта гена. Это биохимические и иммунологические методы.
Регистрация специфичных метаболитов изменённого обмена. Это Цитологические, биохимические и иммунологические методы.
Цитогенетические методы.
С помощью цитогенетических методов можно изучить структуру хромосомного набора или отдельных хромосом.
Среди объектов наблюдения под световым микроскопом, могут выступать: делящиеся соматические клетки, мейотические и интерфазные клетки. Для получения препарата обычно используют культуру лимфоцитов периферической крови.
Несколько миллилитров венозной крови добавляют в питательную среду с фитогемогглютинином, что вызывает трансформацию и деление лимфоцитов. Далее останавливают клеточное деление на стадии метафазы с помощью колхицина. Потом отделяют лейкоциты, добавляют гипотонический солевой раствор, фиксируют и окрашивают клетки, после чего можно микроскопировать.
При окрашивании препарата, следует учитывать, нужно ориентировочное определение числовых аномалий кариотипа, либо определение структурных аномалий. Соответственно нужна либо простая окраски, либо дифференциальная. Преимущества дифференциальной окраски состоит в выявлении структурной дифференцировки хромосом по длине, идентифицируются все хромосомы, плечи и даже определённые районы.
Применяют 4 основных метода дифференциальной окраски: Q, G, R и С. Все они выявляют закономерную линейную неоднородность фрагментов по длине метафазных хромосом. Характер окрашивания специфичен для каждой негомологичной хромосомы, что дает их точную идентификацию. Постоянство локализации окрашиваемых фрагментов позволяет составить «химические» карты хромосом. Сопоставление этих карт с генетическими используется для расшифровки функционально-генетических особенностей различных районов хромосом.
Молекулярно-цитогенетические методы.
Благодаря открытиям медицинской генетики, был разработан метод флюоресцентной гибридизации in sity (FISH), который включает следующие этапы:
1) создание зондов - однонитевых фрагментов ДНК, к которым присоединяют биотин или дигоксигенин.
2) щелочная обработка препаратов in situ с целью денатурации хромосомной ДНК за счет разрыва водородных связей между двумя цепями ДНК.
3) гибридизация хромосомной ДНК с зондом путем комплементарного связывания зонда со специфической последовательностью хромосомы.
4) обработка препаратов веществами, которые избирательно связываются с биотином, к этим веществам могут быть присоединены флуоресцентные красители.
5) визуализация хромосом с помощью люминесцентного микроскопа на фоне неокрашенных хромосом.
Этот метод используют для выявления численных хромосомных аномалий в интерфазном ядре, структурных аномалий, сложных межхромосомных перестроек, учета симметричных аберраций у облученных лиц и локализации гена.
Метод сравнительной геномной гибридизации, используется в онкологической цитогенетике для выявления делетированных или амплифицированных участков хромосом при некоторых типах опухолей. Он заключается в следующем: ДНК, выделенную из опухоли и из нормальной ткани, метят разными флуорохромами. Меченую ДНК из опухоли и нормальной ткани гибридизуют с хромосомным препаратом, и по интенсивности свечения метки определяют участки, содержащие делеции и амплификации. Для обработки данных используют специальные программы компьютерного анализа.
Спектроскопический анализ хромосом. Метод основан на использовании набора зондов и флуоресцентных красителей, имеющих сродство к определенным участкам хромосом. Метод используется в онкоцитогенетике для выявления в кариотипе опухолевых клеток даже очень незначительных по величине хромосомных аберраций.
Биохимические методы.
Использование современных биохимических методов позволяют определять любые метаболиты, специфические для конкретной наследственной болезни. Для биохимической диагностики используются как простые качественные реакции, так и более точные методы. Например, с помощью тонкослойной хроматографии мочи и крови можно диагностировать нарушение обмена аминокислот, олигосахаридов, мукополисахаридов..
Выявление гетерозиготных носителей того или иного заболевания возможно путем использования биохимических тестов, микроскопического исследования клеток крови и тканей, определения, активности фермента, измененного в результате мутации.
Молекулярно-генетические методы.
Молекулярно-генетические методы изучения наследственности человека – это большая группа методов, позволяющих выявлять варианты структуры исследуемого участка ДНК. В основе методов лежат различные манипуляции с ДНК и РНК. Первым этапом любого молекулярно-генетического исследования является выделение нуклеиновых кислот из образца ткани. Для анализа достаточно небольшого фрагмента генома. Для этого исследуемый фрагмент необходимо получить в большом количестве копий. Амплифицировать фрагмент ДНК можно при помощи ПЦР.
Перед анализом молекулы ДНК необходимо разделить на части, обработать разнообразными рестриктазами – бактериальными эндонуклеазами. Фракционирование фрагментов ДНК по размеру и длине проводится с помощью электрофореза на поверхности агарозного или акриламидного геля.
Молекулярно-генетическую диагностику наследственных болезней используют и для изучения генома человека. Чтобы выявить нужные фрагменты проводят гибридизацию ДНК с реактивным ДНК-зондом или клонируемым фрагментом ДНК. Нуклеотидная последовательность зонда должна быть полностью или частично комплементарна изучаемому участку геномной ДНК.
С помощью метода Саузерна можно составить рестрикционную карту генома в участке исследуемого генома и установить, несет ли данный ген какие-либо дефекты.
Список литературы.
1. «Клиническая генетика» Н.П Бочков.