4. Окраска препаратов проводится:

• Простыми методами (водным фуксином Пфейффера, метиленовой синькой Леффлера), когда окрашивается вся клетка и используется только один краситель;

• Сложными методам, когда определяются клеточные структуры,

После экспозиции мазок промывают водой, высушивают фильтроваль­ной бумагой и микроскопируют под иммерсией.

№2 Исследование в биологическом микроскопе мазков из микробной культуры

1) Приготовление препаратов для микроскопического исследования:

Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой. В некоторых случаях используют препаровальные иглы.

Петлю прокаливают в пламени горелки для уничтожения посторонних бактерий. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее 5 и 4 пальцами к ладони и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность стекла, после чего легким скользящим движений захватывают материал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают край пробирки и закрывают пробкой. После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в пламени. Жидкий материал из пробирки или колбы можно набирать пипеткой.

2) Работа с микроскопом

Работа с любым световым микроскопом включает установку правильного освещения поля зрения и препарата и его микроскопию различными объективами. Освещение может быть естественными (дневными) или искусственными, для чего используют специальные источники света – осветители разных марок.

При микроскопировании препаратов с иммерсионным объективом следует строго придерживаться определенного порядка:

1. на приготовленный на предметном стекле и окрашенный мазок нанести каплю иммерсионного масла и поместить его на предметный столик, укрепив зажимами;

2. повернуть револьвер до отметки иммерсионного объектива 90х или 100х;

3. осторожно опустить тубус микроскопа до погружения объектива в каплю масла;

4. установить ориентировочный фокус при помощи макроскопического винта;

5. провести окончательную фокусировку препарата микрометрическим винтом, вращая его в пределах только одного оборота. Нельзя допускать соприкосновения объектива с препаратом, т.к это может повлечь поломку покровного стекла или фронтальной линзы объектива (свободное расстояние иммерсионного объектива 0.1-1 мм).

По окончании работы микроскопа необходимо удалить масло с иммерсионного объектива и перевести револьвер на малый объектив 8х.

№ 3 Простые методы окраски бактериальных препаратов

Простой метод. Фиксированный мазок окрасить каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1-2 мин) или метиленовым синим (3-5 мин), промыть водой, высушить и микроскопировать.

Приготовление и окраска препаратов для люминесцентной микроскопии.

Для люминесцентной микроскопии на предметных стёклах готовят фиксированные препараты-мазки или нативные препараты, которые окрашивают специальными флюоресцентными красителями: акридиновым желтым, ауромином, корифосфином. При работе с иммерсионным объективом используют нефлюоресцирующее масло.

Приготовление препаратов для электронной микроскопии.

Приготовление препаратов для исследования в электронном микроскопе имеет ряд особенностей. Препараты готовят на специальных плёнках-подложках, так как стекло непроницаемо для электронов. Исследуемый объект максимально очищают от посторонних примесей и наносят на плёнку-подложку, предварительно помещённую на опорную металлическую сеточку. Для контрастирования применяют соединения тяжёлых металлов (золото, осмий, рутений и др.).

Измерение микробных клеток.

Измерение микробов осуществляют в ходе микроскопического исследования с помощью специальных приспособлений. Для изменения применяют окуляр-микрометр и объект-микрометр. Окуляр-микрометр служит для непосредственного измерения объекта и представляет собой стеклянную пластинку в окуляре, в центральной части которой нанесена шкала с 50 делениями. Объект-микрометр представляет собой стекло, в средине которого имеется эталонная шкала, разделённая на 100 частей. Цена деления шкалы известна и указана на стекле. Обычно каждое деление шкалы объект-микрометра равно 10 мкм.

Микроорганизмы измеряют окуляр-микрометр, предварительно определив цену его деления с помощью объект-микрометра. Для этого объект-микрометр устанавливают на предметном стекле микроскопа и, вращая винтами для перемещения столика, добиваются, чтобы одно из его делений совпало с каким-либо делением окуляр-микрометра. Затем отмечают число делений объект-микрометра, в которые полностью укладывается число делений окуляр-микрометра. Зная величину деления объект-микрометра (10 мкм), устанавливают величину деления окуляр-микрометра. После этого объект-микрометра при той же степени увеличения, при которой была измерена величина его делений.

Для измерения микроскопических объектов используют следующие метрические единицы: 1 микрометр (мкм)= 10¯³мм, 1 нанометр (нм)= 10¯⁶мм.

Вопрос №4 окраска готовых препаратов по методу Грама

1. На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 минуты ее снять, а краситель слить.

2. Нанести раствор Люголя на 1-2 мин.

3. Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 сек до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промыть водой.

5. Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.

Грам+ окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, Грам- в красный

№5

. Определение морфологических и тинкториальных свойств в готовых препаратах

Бактерии имеют разнообразную форму и довольно сложную структуру. Для бактерий характерны четыре основные формы: сферическая (шаровидная), цилиндрическая (палочковидная), извитая и нитевидная. Бактерии шаровидной формы — кокки — в зависимости от плоскости деления и расположения относительно друг друга от­дельных особей подразделяются на микрококки (отдельно лежащие кокки), диплококки (парные кокки), стрептококки (цепочки кокков), стафилококки (имеющие вид виноградных гроздьев), тетракокки (образования из четырех кокков) и сарцины (паке­ты из 8 или 16 кокков). Палочковидные бактерии располагаются в виде оди­ночных клеток, дипло- или стрептобактерий. Извитые формы бактерий — вибрионы и спириллы, а так­же спирохеты. Вибрионы имеют вид слегка изогнутых палочек, спириллы — извитую форму с несколькими спиральными завит­ками.

Грамположительные бактерии хорошо удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом и устойчивы к обесцвечиванию спиртом. После обработки фуксином они окрашиваются в фиолетовый цвет.

Грамотрицательные бактерии обесцвечиваются спиртом, то есть теряют комплекс генцианового фиолетового с йодом, и хорошо поглощают фуксин. В мазках они окрашиваются в красный цвет.