Химико-токсикологический анализ лекарственных веществ в крови (плазме, сыворотке) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
Дисциплина: Медицинские приборы, аппараты, системы и комплексы
Преподаватель: Садыкова Е.В.
Вид анализа
Метод: Химико-токсикологический анализ лекарственных веществ в крови методом ВЭЖХ-ДМД.
Принцип: Лекарственные вещества из крови экстрагируются жидкость-жидкостной экстракцией (н-гексан, дихлорметан, изопропанол, pH 9.5). Экстракты анализируются ДМД в градиентном режиме, идентификация – по времени удерживания и УФ-спектрам, количественное определение – с внутренним стандартом (MPPH).
Оборудование для проведение анализа: ВЭЖХ-система, ДМД (диодно-матричный детектор), центрифуга, виалы, испаритель, мини- шейкер, пипетки, пробирки, аппарат для встряхивания.
2
Процедура анализа
Этап |
Группа |
Содержание операций и |
Объект |
Операции аналитических методик |
|
преобразований |
преобразования |
||||
|
|
|
1 |
Подготовка лабораторного |
БП (кровь, плазма, |
Подготовка ВЭЖХ системы (включение, проверка параметров, калибровка), диодно- |
|
оборудования и аппаратуры |
сыворотка) |
матричного детектора, оборудования для экстракции, посуды и пипеток |
||
|
Доанали- тический
2 |
Отбор, хранение, доставка БП |
БП, реагенты |
Взятие пробы крови (плазмы, сыворотки) у пациента, транспортировка в лабораторию, |
|
хранение до анализа |
||||
|
|
|
|
|
3 |
Мерные операции |
РС, реагенты |
Внесение в пробирку на 12 мл 0,5 мл бланковой плазмы, добавление по 50 мкл (2 БП) |
|
|
|
калибровочных растворов |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
Про- |
|
|
|
|
|
|
бопод- |
|
Операции, не приводящие к |
|
|
|
Аналити- |
гото- |
|
|
|
|
|
4 изменению агрегатного состояния или |
РС, реагенты |
Перемешивание и настаивание в течение 5 минут |
|
|||
ческий |
ви- |
|
||||
|
биохимических свойств вещества |
|
|
|
||
|
тель- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ный |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
Мерные операции |
РС, реагенты |
Добавление 50 мкл МРРН (внутреннего стандарта), 0,5 мл насыщенного раствора |
|
|
|
сульфата аммония, 0,5 мл аммиачного буфера |
3 |
|||
|
|
|
|
|
||
|
|
|
Операции, не приводящие к |
|
|
|
|
4 |
изменению агрегатного состояния |
РС, реагенты |
Перемешивание |
|
|
|
или биохимических свойств вещества |
|
|
|
Про- |
|
Операции, приводящие к изменению |
|
|
|
бопод- |
|
|
Экстракция, центрифугирование для разделения фаз. Испарение органической фазы |
|
|
5 |
агрегатного состояния или |
РС, реагенты |
||
|
гото- |
досуха при 40°C. Растворение сухого остатка в 100 мкл подвижной фазы |
|||
|
|
биохимических свойств вещества |
|
||
|
ви- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
тель- |
|
|
|
|
|
ный |
|
|
|
|
Аналити- |
|
|
Операции, не приводящие к |
|
|
ческий |
|
|
|
|
|
|
4 |
изменению агрегатного состояния |
РС, реагенты |
Перемешивание |
|
|
|
||||
|
|
|
или биохимических свойств вещества |
|
|
|
Кон- |
|
|
|
|
|
такт- |
6 |
Погружение ПИП, заполнение кюветы |
РС |
Ввод 40 мкл подготовленной пробы в систему ВЭЖХ |
|
ный с |
РС и т. п. |
|||
|
|
|
|
||
|
ПИП |
|
|
|
|
|
Изме- |
|
Линейные и нелинейные |
|
Разделение компонентов пробы на колонке ВЭЖХ. Детектирование веществ диодно- |
|
ри- |
|
|
||
|
7 |
преобразования сигналов, получение |
Сигналы |
матричным детектором. Регистрация времен удерживания и УФ-спектров каждого |
|
|
тель- |
||||
|
|
ДЗП |
|
компонента. Получение данных по площадям пиков |
|
|
ный |
|
|
||
|
|
|
|
|
|
Постана- |
|
|
Обработка и интерпретация |
|
Количественное определение концентрации лекарственных веществ с использованием |
литичес- |
8 |
|
МБП |
внутреннего стандарта и калибровочных графиков (по соотношению площадей пиков |
|
|
результатов |
||||
кий |
|
|
|
вещества и внутреннего стандарта). Расчет концентраций веществ в исходной пробе |
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
4 |
Структурная схема БТС ЛА
5
Критерии для выбора анализатора
●Медицинская задача: предоставление врачу точной информации о наличии в организме лекарств, наркотиков или токсинов для диагностики, лечения и прогноза состояния пациента при отравлениях, интоксикациях и метаболических нарушениях.
●Внешние условия эксперимента: ВЭЖХ анализы проводятся в специализированных клинических лабораториях, оснащенных необходимым оборудованием.
●Технические средства: центрифуга, испаритель, аппарат для встряхивания, мини-шейкер, ВЭЖХ-ДМД система.
●Уровень подготовки персонала: работать с ВЭЖХ могут медицинские лабораторные техники, фармацевты, научные сотрудники и исследователи, специалисты по качеству.
6
Принцип метода
Закон Ламберта-Бера-Бугера:
E=ε(λ)∙C∙d,
где E - оптическая плотность, ε(λ) - молярный коэффициент поглощения, d – длина оптического пути (толщина кюветы, через которую проходит свет), C - концентрация вещества.
7
Цепь первичных преобразований
8
Первичный измерительный преобразователь
Диодно-матричный детектор PDA-3000:
●Диапазон длин волн: 190-800 нм с шагом задания 1 нм
●Однолучевой дизайн оптической схемы с вогнутой голографической решёткой
●Точность задания длины волны: ±1 нм
●Пиксельное разрешение: 0.7 нм
●Количество фотодиодов: 1024
●Источники света: дейтериевая и вольфрамовая лампы
●Изменяемая ширина щели для оптимизации уровня шумов
●Количество каналов регистрации: до 8
●Частота сбора данных: до 100 Гц
●Линейность: <3% до 1.5 AU
●Шум: <10 µAU
●Дрейф: <1 mAU/час
9
Цепь вторичных измерительных преобразователей
10