Промышленное производство продукта
Схема 3 – Технологическая схема производства клеточной культуры
Сосуд Дьюара
Криопробирка
Водяная баня
Бокс биологической безопасности
Центрифуга
СО2 – Инкубатор
Счётчик клеток (Vi - Cell)
рН-метр / кондуктометр
Перистальтический насос
Волновой биореактор
Биореактор
Биохимический анализатор (nova)
Установка глубинной фильтрации
Установка тангенциальной фильтрации
Хромотограф
Линия упаковки и маркировки
Схема 4 – Аппаратурная схема производства клеточной культуры
Таблица 6 - Спецификация оборудования и приборов
Обозначение |
Наименование |
Количество |
1 |
2 |
3 |
СД - 1 |
Сосуд Дьюара |
2 |
ВБ - 2 |
Водяная баня |
1 |
БББ - 3 |
Бокс биологической безопасности |
5 |
Ц - 4 |
Центрифуга |
2 |
И - 5 |
СО2 – Инкубатор |
4 |
СК- 6 |
Счётчик клеток Vi - Cell |
2 |
рН - 7 |
рН-метр / кондуктометр |
6 |
НП - 8 |
Насос перистальтический |
15 |
БТР - 9 |
Волновой биореактор CES 100 L |
60 |
СТИР - 10 |
Биореактор STR 200 л |
1 |
СТИР - 11 |
Биореактор STR 500 л |
1 |
Р - 12 |
Биореактор XDR 10 л |
2 |
Р - 13 |
Биореактор XDR 50 л |
1 |
БА - 14 |
Биохимический анализатор nova |
3 |
ГФ - 15 |
Установка глубинной фильтрации |
5 |
ТФФ - 16 |
Установка тангенциальной фильтрации |
3 |
Х - 17 |
Хромотограф AKTAready |
1 |
Х -18 |
Хромотограф GE |
1 |
КХ - 18 |
Хроматографическая колонка 301 л |
2 |
КХ - 19 |
Хроматографическая колонка 7 л |
2 |
КХ - 20 |
Хроматографическая колонка 1,1 л |
1 |
С - 21 |
Спектрофотометр |
5 |
М - 22 |
Мешалка |
2 |
Х - 23 |
Холодильник |
5 |
Описание технологического процесса
ВР 1. Подготовка производства
ВР 1.1. Подготовка помещений
Перед началом технологического процесса необходимо подготовить производственные помещения. Проводится ежесменная или генеральная уборка помещений по правилам, указанным в стандартных операционных процедурах по подготовке производственных помещений в данном классе чистоты с помощью моющих и дезинфицирующих средств.
ВР 1.2. Подготовка оборудования
Перед началом технологического процесса необходимо подготовить оборудование. Проводится ежесменная или генеральная очистка оборудования по правилам, указанным в стандартных операционных процедурах.
ВР 1.3. Подготовка воды очищенной и воды для инъекций
Воду очищенную (ВО) получают на установке водоподготовки.
Вода для инъекций (ВДИ) находится в петле при температуре 80 - 100˚С, чтобы подготовить воду для операций с ней нужно проверить горит ли красная кнопка, если горит можно нажать на жёлтую и вода начнёт остывать, если кнопка красного цвета мигает надо ждать, когда перестанет мигать. После нажатия на жёлтую вода начнёт охлаждаться, а кнопка начнёт мигать, до тех пор, пока не охладиться вода. Когда загорится жёлтый нужно нажать зелёную кнопку и набрать ВДИ из петли.
ВР 1.4. Подготовка питательной среды
Припасаем все материалы, которые пригодятся для приготовления питательной среды.
Воду для инъекций набираем из петли. Питательная среда BalanCD, GlutoMax храниться в холодильнике при температуре 2 - 8˚С.
ТП 2 Культивирование
ТП 2.1. Разморозка
Криопробирки с клетками в сухом льде размораживают при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане.
После разморозки клетки переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют. Далее в клетки добавляют питательную среду. После переносят в колбу на 125 мл.
ТП 2.2. Культивирование в колбах
За колбой на 125 мл. будут наблюдать и проверять концентрацию и жизнеспособность клеток на счётчике клеток Vi – Cell (СК- 6). После того как концентрация и жизнеспособность клеток достигают определённого значения их пересеивают в колбу большего размера - 250 мл, а следующий пересев в колбу 1000 мл. Клетки в колбах наращивают в СО2 – инкубаторе при температуре 37˚С, содержанием СО2 5% и скорости вращения 120 rpm.
ТП 2.3. Культивирование в волновом биореакторе
Из колбы на 1000 мл с помощью насоса перистальтического (НП – 8) перекачивают всё содержимое в стерильный одноразовый мешок, который помещают в волновой биореактор. Добавляют питательную среду до нужного объёма. Настраивают параметры – частоту качаний, угол наклона, рН, DO, подачу N2, O2, Air, CO2, температура. Наблюдают за жизнеспособностью на счётчике клеток Vi – Cell (СК- 6) и биохимическом анализаторе nova (БА - 14).
ТП 2.4. Культивирование в биореакторе
Из колбы на 1000 мл с помощью насоса перистальтического (НП – 8) перекачивают всё содержимое в стерильный одноразовый мешок, который помещают в волновой биореактор. Добавляют питательную среду до нужного объёма. Настраивают параметры – частоту вращений, рН, DO, подачу N2, O2, Air, CO2, температура. Наблюдают за жизнеспособностью на счётчике клеток Vi – Cell (СК- 6) и биохимическом анализаторе nova (БА - 14).
ТП 3. Заражение клеточной культуры
ТП 3.1. Заражение клеточной культуры в волновом биореакторе
После того как клетки нарастут можно будет заражать их вирусной затравкой. С помощью насоса перистальтического (НП – 8) перекачивают всё содержимое в волновой биореактор. Производят отбор на подсчёт концентрации и жизнеспособности клеток на счётчике клеток Vi – Cell (СК- 6) – они должны снизиться.
ТП 3.2. Заражение клеточной культуры в биореакторе
После того как клетки нарастут можно будет заражать их вирусной затравкой. С помощью насоса перистальтического (НП – 8) перекачивают всё содержимое в биореактор. Производят отбор на подсчёт концентрации и жизнеспособности клеток на счётчике клеток Vi – Cell (СК- 6) – они должны снизиться.
ТП 4. Лизис
ТП 4.1. Внесение в заражённую клеточную культуру бензоназы
Когда клеточная культура заразиться вирусом её начинают лизировать. Для этого в зараженную культуру добавляют бензоназу – фермент разрушающий клетку. Наблюдают за жизнеспособностью, которая должна упасть до 2% и сливают всю лизированную культуру для очистки.
ТП 5. Очистка
ТП 5.1. Глубиная фильтрация
Для глубинной фильтрации необходимы кассеты для фильтрации, заглушки, манометр, трубки с мешками, уравновешивающие буфера, лизированная культура, насос перистальтический, фильтры стерилизующие.
На установке глубинной фильтрации это собирается, подключается и промывается щёлочью, ВДИ и начинается подача лизированной культуры с помощью насоса перистальтического (НП – 8). В мешок для сбора отфильтрованная культура проходит через стерилизующий фильтр.
Концентрат от глубинной фильтрации направляется на тангенциальную фильтрацию.
ТП 5.2. Тангенциальная фильтрация (ТФФ)
Для тангенциальной фильтрации необходимы кассеты для фильтрации, манометр, трубки с мешками, уравновешивающие буфера, концентрат от глубинной фильтрации, насос перистальтический.
На установке тангенциальной фильтрации это собирается, подключается и начинается подача концентрат от глубинной фильтрации с помощью насоса перистальтического (НП – 8).
Концентрат от тангенциальной фильтрации направляется на анионную хроматографию.
ТП 5.3. Анионная хроматография (АХ)
Для анионной хроматографии необходим хроматограф AKTAready, хроматографическая колонка на 7 литров, концентрат от тангенциальной фильтрации, , мешки одноразовые стерильные для сбора эфлюента, ВДИ.
Подключаем к хроматорафу AKTAready (Х - 17) колонку хроматографическую (КХ - 19) промываем ВДИ, уравновешивающим буферным раствором. Наносим концентрат от тангенциальной фильтрации и осуществляем сбор проскока/эфлюента в стерильный одноразовый мешок. Вытесняем концентрат уравновешивающим буферным раствором. Промыть санитизирующим раствором (NaOH), ВДИ и раствором для хранения (20% этанол).
Отбирается проба на оптическую плотность на спектрофотометре (С – 21), а также на электропроводность.
ТП 5.4. Мультимодальная хроматография (ММХ)
Для анионной хроматографии необходим хроматограф AKTAready, хроматографическая колонка на 1,1 литр, эфлюент от анионной хроматографии, санитизирующий раствор (NaOH), уравновешивающий буфер, бессолевой раствор, мешки одноразовые стерильные для сбора эфлюента, ВДИ.
Подключаем к хроматорафу AKTAready (Х - 17) колонку хроматографическую (КХ - 20) промываем ВДИ, уравновешивающим буферным раствором. Наносим эфлюент от анионной хроматографии и осуществляем сбор проскока/эфлюента в стерильный одноразовый мешок. Вытесняем эфлюент уравновешивающим буферным раствором. Промыть санитизирующим раствором (NaOH), ВДИ и раствором для хранения (20% этанол).
Отбирается проба на оптическую плотность на спектрофотометре (С – 21), а также на электропроводность.
УМО 6. Упаковка и маркировка
УМО 6.1. Розлив по флаконам
На упаковочном автомате происходит розлив продукта в ампулы для введения в полость тела.
УМО 6.2. Линия упаковки
На упаковочном автомате происходит упаковка ампул в картонные коробки с приложением инструкции по применению.
УМО 6.3. Линия маркировки
Происходит нанесение маркировки о лекарственном препарате на картонные коробки.
Таблица 7 - Микробиологический контроль процесса (Км)
Стадия технологического процесса |
Контролируемые показатели |
КИП |
Нормативные документы, назначение |
Действия по регулированию процесса |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
ВР 1.1. Подготовка помещений |
Микробиологическая обсеменённость |
Чашка Петри – Счётчик колоний микроорганизмов |
Протокол производства, маршрутные карты, СОП |
Правильная уборка помещения моющими и дезинфицирующими средствами |
ВР 1.2. Подготовка оборудования |
Микробиологическая обсеменённость |
Пробирка с мазком - Счётчик колоний микроорганизмов |
Протокол производства, маршрутные карты, СОП |
Правильная очистка оборудования моющими и дезинфицирующими средствами |
ТП 2. Культивирование |
Жизнеспо-собность клеток |
Счётчик клеток Vi Cell, биохимический анализатор nova |
Протокол производства |
Добавление подпитки / регулирование рН |
Концентрация целевого белка |
Спектрофотометр |
– |
||
ТП 3. Заражение клеточной культуры |
Жизнеспо-собность клеток |
Счётчик клеток Vi Cell |
Протокол производства |
– |
ТП 4. Лизис |
Жизнеспо-собность клеток |
Счётчик клеток Vi Cell |
Протокол производства |
– / Добавление бензоназы |
ТП 5. Очистка |
Электропроводность |
рН-метр / кондуктометр |
Протокол производства |
– / Разбавление бессолевым раствором |
Таблица 8 – Химический контроль процесса (Кх)
Стадия, операция продукта |
Оборудование |
Контролируемые показатели |
1 |
2 |
3 |
ВР 1.4. Подготовка питательной среды |
Мешалка (М - 22) |
pH, растворимость |
ТП 5.1. Глубиная фильтрация |
Установка глубинной фильтрации (ГФ - 15) |
Очищение после фильтра |
ТП 5.2. Тангенциальная фильтрация |
Установка тангенциальной фильтрации (ТФФ – 16) |
Концентрат, ретентат, пермеат |
ТП 5.3. Анионная хроматография |
Хромотограф AKTAready (Х – 17), хроматографическая колонка 7 л (КХ – 19) |
Электропроводность, оптическая плотность |
ТП 5.4. Мультимодальная хроматография |
Хромотограф AKTAready (Х – 17), хроматографическая колонка 1,1 л (Х – 20) |
Электропроводность, оптическая плотность |
Таблица 9 – Технологический контроль процесса (Кт)
Стадия технологического процесса |
Контролируемые показатели |
Оборудовани (узел аппарата) |
КИП |
Нормативные документы назначение |
Действия по регулированию процесса |
ВР 1.4. Подготовка питательной среды |
Температура |
Мешалка (М - 22), |
Термометр, спидометр |
Протокол производст-ва, маршрут-ные карты, СОП |
Подогнать под установленную норму
|
Холодильник (Х - 23) |
Термометр |
||||
ТП 2.2. Культивирование в колбах |
Температура |
СО2 – Инкубатор (И – 5) |
Термометр |
||
Частота оборотов |
Шейкер |
||||
Давление |
Манометр |
||||
ТП 2.3. Культивирование в волновом биореакторе
|
Температура |
Волновой биореактор CES 100 L (БТР – 9) |
Термометр |
||
Частота качаний |
– |
||||
Угол наклона |
|||||
Давление |
Манометр |
||||
рН |
Датчик рН |
||||
DO |
Датчик DO |
||||
ТП 2.4. Культивирование в биореакторе |
Температура |
Биореактор |
Термометр |
||
Частота оборотов |
Шейкер |
||||
Давление |
Манометр |
||||
рН |
Датчик рН |
||||
DO |
Датчик DO |
||||
ТП 5.1. Глубиная фильтрация |
Давление |
Установка глубинной фильтрации (ГФ - 15) |
Манометр |
Регулировка оборотов насоса |
|
ТП 5.2. Тангенциальная фильтрация |
Давление |
Установка тангенциальной фильтрации (ТФФ – 16) |
Манометр |
||
Т Продолжение таблицы 9 – Технологический контроль процесса (Кт) П 5.2. Анионная хроматография |
Давление |
Хромотограф AKTAready (Х – 17), хроматографическая колонка 7 л (КХ – 19) |
Манометр |
||
Температура |
Термометр |
Подогнать под установленную норму |
|||
ТП 5.4. Мультимодальная хроматография |
Давление |
Хромотограф AKTAready (Х – 17), хроматографическая колонка 1,1 л (Х – 20) |
Манометр |
Регулировка оборотов насоса |
|
Температура |
Термометр |
Подогнать под установленную норму |
Таблица 10 - Технологические нарушения
Технологическое отклонение /брак |
Причина брака |
Мероприятия |
|
корректирующие |
предупреждающие |
||
1 |
2 |
3 |
4 |
Не работает мешалка |
Прокручивается вал мешалки при 110 об./мин |
Заменить деталь вала |
Контролировать скорость мешалки |
Прорезы на одноразовом мешке для культивирования |
Давление ниже нормы при испытании |
Заменить мешок |
Проверить мешок на наличие других дефектов |
Не работает датчик веса |
Датчик веса отключён |
Подключите датчик веса
|
Проверить включенность датчика веса |
Клапаны не открываются или не закрываются |
Не работает подача воздуха в систему |
Убедитесь, что давление входящего воздуха находится в диапазоне, отображаемом на лицевой панели PID. |
Проверить клапаны в положениях открыто/закрыто |
Контроль температуры не работает |
Отказал температурный зонд |
Переключитесь на второй вход температурного зонда, если он исправен |
Проверить включенность датчика температуры |
Давление в мешке слишком высоко |
Кабель датчика давления в мешке не соединен с датчиком в сборе |
Убедитесь, что разъем кабеля ориентирован правильно и обе его части прочно прилежат |
Проверить соединение кабеля с датчиком давления |
Мешок с клеточной культурой не нагревается |
Поврежден кабель |
Проверить надежность соединения |
Осмотр оборудования перед работой |
Отключение электроэнергии |
Сбой в системе электросети |
Немедленно сообщить руководителю направления/начальнику УПТБ |
Повторный инструктаж |
Система не может установить связь со шкафом платформы |
Отключение сети |
Убедиться, что питание шкафа включено, модуль CEM подключен |
Осмотр оборудования перед работой |
Нагреватель фильтра отходящих газов не работает |
Кабель поврежден и требует замены |
Сообщить специалисту СА ДИТ |
Проверить на наличие других дефектов |