2. Практическая часть (по месту практики)

   1. Характеристика сырья, основных и вспомогательных материалов, готового продукта

Сырьём являются эукариотические клетки – клеточная культура НЕК293. HEK 293 (англ. Human Embryonic Kidney 293) — клеточная линия, полученная из эмбриональных почек человека.

Наиболее широкое распространение HEK 293 получили как клетки-хозяева при размножении различных вирусных векторов. Вирусы являются наиболее эффективной формой доставки генетического материала в клетки. Однако, обладая высокой патогенностью, вирусы могут представлять определенный риск при проведении экспериментов. Подобного рода риск может быть устранен разделением вирусного генома на части и удалением из него генов, ответственных за вирусную репликацию. Для репликации таким модифицированным вирусам необходима клетка-хозяин, которая экспрессирует недостающие гены. Так как HEK293 экспрессируют подобные аденовирусные гены, они могут быть использованы как подходящие клетки-хозяева для продукции аденовирусов.

Клетки HEK 293 были адаптированы для роста в суспензионной культуре. Это позволило выращивать большие количества рекомбинантных аденовирусных векторов. Ячейки HEK 293 -

Криопробирки с клетками в сухом льде размораживают при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане.

Пересев и отбор проб из колб проводят в боксе биологической безопасности (БББ). Перед процедурой пересева или отбора проб нужно протереть БББ спиртом, подержать под УФ - светом и продуть воздухом и снова протереть спиртом, после этого в БББ можно проводить работы.

После разморозки клетки переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют. Далее в клетки добавляют питательную среду. После переносят в колбу на 125 мл.

За колбой на 125 мл. будут наблюдать и проверять концентрацию и жизнеспособность клеток. После того как концентрация и жизнеспособность клеток достигают определённого значения их пересеивают в колбу большего размера - 250 мл, а следующий пересев в колбу 1000 мл.

Из колбы на 1000 мл с помощью перистальтического насоса перекачивают всё содержимое в стерильный одноразовый мешок, который помещают в волновой биореактор или реактор. После того как клетки нарастут можно будет заражать их вирусной затравкой.

Далее заражённую клеточную культуру очищают с помощью глубинной, тангенциальной фильтрации и хромотографии.

Таблица 4 - Характеристика вспомогательных материалов

Наименование	Обозначение НД, ГОСТ	Сорт или артикул	Показатели, обязательные для проверки	Назначение
1	2	3	4	5
Изопропиловый спирт CH3CH(OH)CH3	ГОСТ 9805-84	1451373	Процентность	Дезинфекция
Вода очищенная H2O	ГОСТ 6709-97	4014835300453	Микробиологическая чистота	Промывка
Натрия гидроксид NaOH	ГОСТ 4328-77	141687.1210	Растворимость	Доп.сырье

Таблица 5 - Основные свойства субстанции

Свойства	Значения	НД
1	2	3
Бактериальные эндотоксины	Меньше 1 Определение содержания бактериальных эндотоксинов проводят с помощью реактива, представляющего собой лизат клеток крови	ОФС.1.2.4.0006.15
Микробиологическая чистота	Испытание включает способы подготовки различных лекарственных форм, отбор образцов для анализа, методы количественного определения жизнеспособных микроорганизмов, выявление и идентификацию отдельных видов бактерий,	ОФС.1.2.4.0002.15
Стерильность	Данное испытание вводят для субстанций, используемых в п Продолжение таблицы 5 - Основные свойства субстанции роизводстве готовых стерильных лекарственных средств, которые не подвергаются процедуре стерилизации	(«ОФС.1.1.0006.15»,Стерильность)
Остаточная ДНК штамма-продуцента методом гибридизации с зондами, меченными биотином, дигоксигенином	Фармацевтические субстанции указанных лекарственных средств (биологические фармацевтические субстанции) получают с помощью культур охарактеризованных клеток, используемых в качестве систем экспрессии, которыми могут быть бактерии, дрожжи, клетки млекопитающих	ОФС.1.7.1.0007.15 Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантной ДНК
Остаточные белки клетки хозяина - иммунохимическими методами	Иммунохимические методы для определения остаточных белков штамма-продуцента должны отвечать следующим требованиям: антиген должен представлять максимально возможное количество белков-антигенов	ОФС.1.7.1.0007.15 Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантной ДНК