история становления гистологии как науки

Глава 3

ющий информацию о мышечном напряжении (сухожильный органГольджи) [78],изучал микроскопическое строение почек во время различной патологии [40] и в 1898 году открыл одну из органелл общего значения — аппарат (комплекс) Гольджи, который назвал apparato reticolare interno (итал. внутренний сетчатый аппарат) [42].

Рис. 15. Обложка и одна из страниц книги Камилло Гольджи «Обонятельная луковица», 1875 год. Библиотека Института Кахаля Высшего совета по научным исследованиям Испании, Мадрид, Испания

Воодушевленный недавно открытым методом Гольджи, позволяющим четко визуализировать нейроны в микропре- паратах,испанский нейробиолог Сантьяго Рамон-и-Кахаль начинает свои исследования в области нейрогистологии. В 1890 году он описывает конус роста нейрита (аксона) ней- рона [84], чем доказывает, что связь в нервной системе обе- спечивается не непрерывной сетью нервных волокон (рети-

30

История гистологии, цитологии в XIX веке

кулумом по Герлаху, см. выше), а дискретными контактами между клетками нервной системы — нейронами [44]. Этим Рамон-и-Кахаль заложил начало сформулированной им же нейронной теории, основные положения которой сводятся ктому,что(1)нервнаясистемасостоитизотдельныхклеток— нейронов, (2) связь между нейронами осуществляется с по- мощью специализированных контактов — синапсов, которые могут быть возбуждающими или тормозными, (3) функцио-

нально нейрон может находиться либо в состоянии возбуждения, либо в состоянии покоя, (4) импульс распространяется по нейрону от дендрита к нейриту (аксону). Помимо открытия конуса роста аксона и первого формулирования нейронной теории, Сантьяго Рамон-и-Кахаль описывает множество раз- личных структур в нервной системе (рис. 14, 16).

Рис. 16. Сравнение зрительной коры (слева) и моторной коры (в центре) взрослого человека с корой ребенка 6 недель (справа).

Рисунки Сантьяго Рамон-и-Кахаля из книги «Сравнительное изучение сен- сорных зон коры головного мозга человека» (стр.314,361 и 363),1899 год

31

Глава 3

Как позже покажут данные электронной микроскопии (в середине XX века, с открытием первого электронного ми- кроскопа, см. ниже), Рамон-и-Кахаль был прав относительно

нейронной теории строения нервной системы. Однако в свое время Камилло Гольджи так и не принял положения нейрон- ной теории, до конца оставаясь верным сформулированной им ретикулярной теории [73]. Несмотря на это, в 1906 году

Камилло Гольджи и Сантьяго Рамону-и-Кахалю присуж-

дается Нобелевская премия по физиологии или медицине [95].

32

Введение

Глава 4 ИСТОРИЯ ГИСТОЛОГИИ,ЦИТОЛОГИИ

ВXX–XXI ВЕКАХ

4.1.Открытие основных методов гистологической окраски

Говоря о развитии методов гистологической окраски,

в 1900 году Фрэнк Барр Маллори сообщает о новом методе окрашивания — о трихромном окрашивании (по Маллори) [75]

для выявления коллагена; в 1913 году Иоахим Вильгельм Роберт Фёльген сообщает об открытии им его известной реакции (Фёльгена)для выявления нуклеиновых кислотпод воз- действиемсолянойифуксинсернистойкислот[43];КлодПьер Массон в 1921 году заявляет об изобретении метода трих-

ромногоокрашивания(поМассону)[37]для выявления различ-

ных структур соединительных тканей; также изобретаются судановые красители(судан I,II,III,IV,черный,красный)для выявления липофильных структур, а также огромное множе- ство иных методов гистологической окраски.

По мере накопления научного знания — его расшире- ния и углубления, открываются все более и более специфичные новые методы гистологической окраски, рассказывать о каждом из которых не представляется возможным в рамках данной работы, ввиду чего ограничимся описанными выше основными наиболее применявшимися методами как в свое время,так и до сих пор.

4.2. Развитие микроскопии

История развития микроскопии в XX веке знаменует-

ся изобретением большого количества различных новых, в

33

Введение

сравнении со световым микроскопом, методов визуализа- ции гистологических изображений. Статичность препаратов, просматриваемых при классической световой микроскопии (рис. 17), не позволяла наблюдать процессы, происходящие в клетках,вреальномвремени,всвязисчемначалисьпопытки наблюдать за живыми тканями вне организма.

Так, американский биолог Росс Гренвилл Гаррисон в

1907 году открывает метод культивирования тканей — вы-

ращивания живых клеток в лабораторных условиях in vitro [8]. Он наблюдает за развитием нервных волокон в зароды- ше лягушки, погрузив его в каплю лимфы, накрытую по- кровным стеклом и запечатанную парафином.Втом же 1907 году в Париже Юлиус Райс снимает первый микроскопический фильм — «Оплодотворение и развитие яйца морского ежа» (рис. 18) [67].

Рис. 17. Принципиальное устройство светового микроскопа. Автор — художник-иллюстратор Ольга Пшатник, 2019 год

34

Введение

Рис. 18. Раскадровка фильма «Оплодотворение и развитие яйца морского ежа». Юлиус Райс, Париж, 1907

4.2.1.Электронная микроскопия

В1931 году немецкие инженер-электрик Макс Кнолль и

физик Эрнст Август Руска разработали первый электронный микроскоп—трансмиссионный (просвечивающий) электрон- ный микроскоп (ТЭМ), работающий по тем же принципам что и оптический,но использующий электроны вместо фото- нов и электромагниты вместо стеклянных линз. Это позво- лило достичь гораздо большего увеличения, поскольку длина волны электрона на 5 порядков (в 100 000 раз) меньше, чем у фотона (рис.19).Спустя 4 года,в 1935 году,Макс Кнолль изо- бретает сканирующий электронный микроскоп (СЭМ) [64].

Тем не менее электронная микроскопия вплоть до окон- чания Второй мировой войны (1939–1945 годы) остается по большей части экспериментальной областью, не получившей распространения. Лишь впоследствии разрабатываются пер- вые коммерческие электронные микроскопы (первый из них—

«Stereoscan» компании Cambridge Instrument Company 1965 года).

35

Введение

Рис. 19. Принцип работы ТЭМ.Автор — художник-иллюстратор Ольга Пшатник, 2019 год

Позднее, в 1986 году, Эрнст Август Руска получит Нобе- левскую премию по физике «за работу над электронным ми- кроскопом» [25].

4.2.2. Фазово-контрастная микроскопия

Параллельно изобретению электронной микроскопии в 1933 году в Нидерландах физик Фриц Цернике описывает

физический метод фазового контраста, на основании кото-

рого через 10 лет, в 1943 году, будет построен первый фазо-

во-контрастный микроскоп, а спустя еще 10 лет, в 1953 году, Фриц Цернике получит Нобелевскую премию по физике «за

36

Введение

обоснование фазово-контрастного метода, особенно за изо- бретение фазово-контрастного микроскопа» (рис. 20) [30].

Рис. 20. Принцип работы фазового контраста. Автор — художник-иллюстратор Ольга Пшатник, 2019 год

4.2.3. Флуоресцентная микроскопия

Еще до изобретения первого электронного и фазово-кон- трастного микроскопов, в 1911 году немцем Оскаром Хейм-

штадтом был изобретен первый флуоресцентный микроскоп,

в котором источник света возбуждал свечение во флуорес- центных веществах, находящихся в просматриваемом ми- кропрепарате. В 1929 году микроскоп Хеймштадта значи-

тельно улучшили Филипп Эллингер и Август Хирт,добавив светофильтры,отсекавшие возбуждающий свет,что позволи- ло наблюдать даже слабую флуоресценцию (рис. 21) [63]. Это дало толчок развитию биохимии и генетики, однако еще не существовало инструмента, способного точно маркировать отдельные белки — антител.

Ключевым моментом в развитии флуоресцентной микро- скопии стало выделение зеленого флуоресцентного белка

37

Введение

(GFP) из медузы Aequorea victoria Осаму Шимомурой в 1962

году [29]. Впоследствии GFP-белки стали связывать с изучае- мыми белками, создавая так называемые белки-химеры, что привело к появлению флуоресцентных белков. В 2008 году Осаму Шимомуре была присуждена Нобелевская премия по химии «за открытие и разработку зеленого флуоресцентного белка» [27].

Рис. 21. Принцип работы флуоресцентной микроскопии. Автор — художник-иллюстратор Ольга Пшатник, 2019 год

4.2.4.Конфокальная микроскопия

В1957 году американский ученый Марвин Ли Минский изобретает, а в 1961 году патентует первый конфокальный микроскоп [92], который позволил реконструировать трех- мерные изображения из послойно снятых фотографий флу- оресцирующих препаратов разной фокусировки. Позднее,

38

Введение

в 1978 году, немецкие физики Томас и Кристоф Кремеры

предложили применять в качестве источника света лазер, в связи с чем конфокальная микроскопия стала полноценной альтернативой-модификацией фазовому контрасту (рис. 22).

Рис. 22. Принцип работы конфокальной микроскопии. Автор — художник-иллюстратор Ольга Пшатник, 2019 год

4.2.5.Микроскопия суперразрешения

В1990-х годах начались разработки по преодолению дифракционного предела Аббе (см. выше) для получения как мож- но более четкого изображения.Так,немецкий оптик Штефан Хелль в 1994 году разрабатывает STED-микроскопию, соглас- но методике которой возбуждение флуорофора происходит

спомощью двух лазеров — один возбуждает флуоресценцию в точке фокуса, в то время как другой тушит ее вокруг этой точки за счет смещения флуоресценции в более красную об- ласть [56]. Идея Хелля заключалась в использовании стиму- лированного излучения: первый лазер работал также, как и

39