Абсорбционная спектроскопия макромолекул: белки

АННОТАЦИЯ

Были сняты и проанализированы спектры поглощения растворов БСА, триптофана и тирозина, растворённых в фосфатном буфере и растворе гидроксида натрия. Установлено, что абсорбционные свойства БСА схожи с триптофаном. При денатурации белка мочевиной наблюдается уменьшение коэффициента экстинкции.

ВВЕДЕНИЕ

Молекулы поглощают свет. Длины волн, при которых происходит поглощение, и степень поглощения зависят от структуры и окружения молекулы, поэтому абсорбционная спектроскопия является полезным инструментом для характеристики макромолекул различного размера.

Первичная структура белка – последовательность аминокислот в полипептидной цепи.

Вторичная структура белка – локальное упорядочивание фрагмента полипептидной цепи, стабилизированное водородными связями. α-спирали – плотные витки вокруг длинной оси молекулы, один виток составляют 3,6 аминокислотных остатка, и шаг спирали составляет 0,54 нм, спираль стабилизирована водородными связями между H и O пептидных групп, отстоящих друг от друга на 4 звена. β-листы (складчатые слои) – несколько зигзагообразных полипептидных цепей, в которых водородные связи образуются между относительно удалёнными друг от друга (0,347 нм на аминокислотный остаток) в первичной структуре аминокислотами или разными цепями белка.

Третичная структура — пространственное строение полипептидной цепи. Структурно состоит из элементов вторичной структуры, стабилизированных различными типами взаимодействий, в которых гидрофобные взаимодействия играют важнейшую роль. В стабилизации третичной структуры принимают участие: ковалентные связи (между двумя остатками цистеина — дисульфидные мостики); ионные связи между противоположно заряженными боковыми группами аминокислотных остатков; водородные связи; гидрофильно-гидрофобные взаимодействия при взаимодействии с окружающими молекулами воды белковая молекула

«стремится» свернуться так, чтобы неполярные боковые группы аминокислот оказались изолированы от водного раствора; на поверхности молекулы оказываются полярные гидрофильные боковые группы.

Четвертичная структура – взаимное расположение нескольких полипептидных цепей в составе единого белкового комплекса.

Оптическая плотность в спектроскопии – это мера ослабления света прозрачными объектами.

𝐷 = lg ^𝐼0

𝐼

(1)

Закон Бугера — Ламберта — Бера — физический закон, определяющий ослабление параллельного монохроматического пучка света при распространении его в поглощающей среде:

𝐷 = 𝐶𝑙𝜀 (2)

где D - оптическая плотность раствора, l - длина пути, которую прошёл пучок света в растворе, ɛ - коэффициент молярной экстинкции. Коэффициент молярной экстинкции показывает насколько сильно химическое вещество поглощает свет при определенной длине волны. Зависимость вероятности поглощения от длины волны называют спектром поглощения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Приготовление растворов для исследования:

Получите порошок белка (БСА). Рассчитайте, навеску какой массы вы должны сделать, чтобы получить 2 мл раствора концентрации 1*10-5 М (учитывая, что молекулярная масса БСА около 67000 Да). Проверьте свои расчеты у преподавателя. Приготовьте навеску белка и растворите её в 2 мл фосфатного буфера (рН 7). Дайте раствору постоять не менее 20 мин в темном прохладном месте. Растворы тирозина и триптофана в двух средах получите у преподавателя.

Приготовьте (или получите у преподавателя) растворы аминокислот тирозина и триптофана. Молекулярная масса триптофана 204, тирозина – 181, требуемая концентрация – не менее 5*10-4 М.

2. Измерение спектров поглощения белка и аминокислот:

А) Измерьте спектры поглощения раствора белка (концентрация 1*10-5 М) в буфере, а триптофана (5*10-5 М) и тирозина (5*10-4 М) в двух средах – растворе NaOH и фосфатном буфере.

Условия измерения: диапазон 260 – 400 нм, шаг 2 нм (medium), объем жидкости в кювете – не менее 2 мл.

Б) Измерьте спектр поглощения денатурированного белка. Для этого доливайте маленькими дозами в измерительную кювету с белком и в кювету сравнения денатурирующий агент, указанный преподавателем, или проведите термоденатурацию. После каждой добавки агента регистрируйте спектр поглощения до тех пор, пока спектр не перестанет изменяться.

РЕЗУЛЬТАТЫ

№	Образец	Максимум поглощения
		, нм	D	, M-1 см-1
1.	Trp + NaOH	279	0,055	1100
2.	Trp + buf	279	0,043	860
3.	Tyr + NaOH	292	0,215	430
4.	Tyr + buf	275	0,051	102
5.	Альбумин + вода	279	0,215	21500
6.	Альбумин + вода + 0,1 мл мочевины	278	0,204	21429
7.	Альбумин + вода + 0,2 мл мочевины	278	0,203	22332
8.	Альбумин + вода + 0,3 мл мочевины	279	0,177	20344
9.	Альбумин + вода + 0,4 мл мочевины	278	0,203	24340
10.	Альбумин + вода + 0,5 мл мочевины	278	0,165	20471
11.	Альбумин + вода + 0,6 мл мочевины	278	0,165	21456
12.	Альбумин + вода+ 0,7 мл мочевины	279	0,158	21322
13.	Альбумин + вода + 0,8 мл мочевины	278	0,154	21568
14.	Альбумин + вода+ 0,9 мл мочевины	278	0,147	21304
15.	Альбумин + вода+ 1,0 мл мочевины	278	0,142	21289
16.	Альбумин + вода+ 1,1 мл мочевины	279	0,129	20000
17.	Альбумин + вода+ 1,2 мл мочевины	279	0,12	19200
18.	Альбумин + вода+ 1,3 мл мочевины	278	0,139	22937
19.	Альбумин + вода+ 1,4 мл мочевины	279	0,125	20593
20.	Альбумин + вода+ 1,5 мл мочевины	278	0,119	20135
21.	Альбумин + вода+ 1,6 мл мочевины	278	0,116	20173
22.	Альбумин + вода+ 1,7 мл мочевины	278	0.114	20357
23.	Альбумин + вода+ 1,8 мл мочевины	278	0,109	16873
24.	Альбумин + вода+ 1,9 мл мочевины	279	0,109	20488
25.	Альбумин + вода+ 2,0 мл мочевины	278	0.108	20789
26.	Альбумин + вода+ 2,1 мл мочевины	278	0,104	20512
27.	Альбумин + вода+ 2,2 мл мочевины	278	0,097	19635
28.	Альбумин + вода+ 2,3 мл мочевины	278	0.09	18595
29	Альбумин + вода+ 2,4 мл мочевины	278	0,091	19238

Таблица 1. Максимумы поглощения растворов триптофана (С = 5·10^-5 М), тирозина (С = 5·10^-4 М) и бычьего сывороточного альбумина (С = 1·10^-5 М).

Рис.1. Спектры поглощения триптофана в Буфере и в NaOH

Рис. 2. Спектры поглощения тирозина в Буфере и в NaOH

Рис.3. Спектры поглощения БСА в воде

Рис.4. Спектры поглощения БСА при добавлении мочевин

ВЫВОДЫ

Абсорбционные свойства белка схожи со свойствами триптофана. Максимальная длина волны и у БСА, и у триптофана равна 279нм.

Повышение рН сдвигает спектр в длинноволновую область спектра

С повышением концентрации мочевины увеличивается коэффициент экстинкции, что свидетельствует о том, что при денатурации белка количество поглощающего света им уменьшается

При денатурации БСА мочевиной спектр белка не изменял форму спектра. Наблюдается увеличение коэффициента молярной экстинкции, что связано с изменением структуры белка в результате денатурации, а оптическая плотность варьируется от 278 до 279 нм, так как допущена ошибка в разведении аминокислот.

Из-за неправильного разведения аминокислот (тирозина и триптофана) невозможно корректно оценить коэффициент молярной экстинкции.

Спектры поглощение уходят в отрицательные значения по причине неправильного вычета фона, что можно исправить при повторном измерении поглощения фона отдельно.

В нашей работе не наблюдается светорассеяние.