1 этап: посев бактерий на чашку Петри (рис.8)

Ход работы: пробирку с бактериальной культурой берут в левую руку, а петлю за петледержатель - в правую (между большим, средним и указательными пальцами). Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее безымянным пальцем и мизинцем правой руки к ладони. Обжигают край пробирки в пламени спиртовки. Затем прожигают бактериальную петлю в пламени спиртовки до покраснения. Осторожно вводят петлю в пробирку, касаются агара (допустимо также охлаждение петли о внутреннюю поверхность пробирки), после чего легким скользящим движением берут материал с поверхности агара. Вынимают петлю из пробирки. Обжигают в пламени край пробирки и затыкают ее пробкой. Помещают материал на чашку Петри с плотной питательной средой. После работы петлю обязательно еще раз прожигают в пламени спиртовки.

Рис. 8. Перенос материала бактериологической петлей на чашку Петри.

Существует два основных метода посева материала для получения чистой культуры: посев сплошным газоном

ипосев секторами.

1.Посев сплошным газоном (по Дригальскому) (рис. 9a). Материал наносят на поверхность питательной среды петлей или пипеткой (см. выше). Металлический или стеклянный шпатель стерилизуют, окуная его в емкость с этанолом, а затем обжигают в пламени спиртовки (не накаливая). Приоткрывают невысоко крышку чашки Петри и, касаясь внутренней стороны крышки, остужают шпатель в течение 2-3 с. Затем тщательно распределяют материал по всей поверхности агара круговыми движениями при помощи шпателя. При этом левой рукой можно придерживать слегка приоткрытую крышку и одновременно поворачивать дно чашки. После посева шпатель стерилизуют вновь. После инкубации посева в термостате (18-24 ч, 37°С) можно обнаружить изолированные колонии. Посев сплошным газоном может также использоваться при определении чувствительности культуры к антибиотикам и фаготипировании.

Рис. 9. Методы посева, используемые для получения чистой культуры. a) - посев сплошным газоном, b) - посев на секторы.

2. Посев на секторы (рис. 9b). Небольшое количество культуры наносят на поверхность агара следующим образом: посевной материал втирают петлей в поверхность среды у края чашки, избыток снимают, проколов петлей агар, а оставшийся материал рассеивают параллельными штрихами по стерильной поверхности среды (сектор 1). Прожигают бактериальную петлю в пламени спиртовки. Поворачивают чашку Петри. Проводят петлей 2-3 параллельных штриха, касаясь 1-го сектора (сектор 2). Вновь прожигают петлю и повторяют действия (секторы 3, 4). Таким образом, в каждом последующем секторе концентрация бактерий будет меньше, чем в предыдущем. После инкубации (18-24 ч, 37°С) в зоне последних секторов будут видны единичные изолированные колонии.

2 этап Накопление чистой культуры

Для заключительной идентификации бактерий требуется достаточное количество бактериальной массы. Поэтому, на втором этапе бактериологического анализа осуществляют накопление биомассы чистой культуры, полученной из изолированной бактериальной колонии.

Практическая работа: накопление чистой культуры

Ход работы: часть изучаемой колонии берут для приготовления мазка. Если при микроскопии подтверждается однородность колонии (бактерии имеют одинаковую морфологию и тинкториальные свойства), то оставшуюся часть колонии пересевают с чашки Петри на скошенный агар для накопления чистой культуры бактерий. Бактериальную петлю стерилизуют в пламени спиртовки. Стерильной петлей отбирают часть бактериальной колонии с чашки Петри (рис. 10). Снимают ватную пробку с пробирки и, придерживая ее мизинцем, переносят материал в пробирку со скошенным агаром. Материал наносят на поверхность скошенного агара штрихообразными (зигзагообразными) движениями снизу вверх, начиная с конденсационной воды. Закрывают пробирку, помешают ее в термостат (37°C). Через 18-24 часа получают количество бактериальной массы, достаточное для исследования.

Рис. 10. Пересев бактерий на скошенный агар (этап накопления чистой культуры).

F. Принципы идентификации бактерий

Заключительная идентификация бактерий может быть основана на определении следующих свойств:

-биохимическая (ферментативная) активность

-антигенная структура

-чувствительность к бактериофагам.

1. Определение биохимической (ферментативной) активности. Бактерии выделяют экзоферменты, участвующие в разложении питательных субстратов. Ферментативный (биохимический) профиль многих бактерий является довольно постоянным, что используется для идентификации микроорганизмов. Штамм бактерий, идентифицированный с помощью биохимических тестов, называется биотип/ биовар.

Для определения особенностей метаболизма бактерий используют различные методы. Выявления тех или иных ферментов возможно при использовании дифференциально-диагностических сред, включающих индикаторы. Например, классические жидкие среды Гисса (в пробирках) используют для изучения сахаролитических и протеолитических свойств. Изменение цвета такой среды происходит, если микроорганизм синтезирует фермент, способный разлагать субстрат, содержащийся в среде. Дополнительные исследования могут использоваться для обнаружения различных биохимических свойств бактерий: каталазной, оксидазной, коагулазной, лецитиназной, уреазной активности, способности выделять индол, сероводород, аммиак и т. д . (табл. 3).

В настоящее время вместо сред Гисса чаще используются коммерческие мини-системы для биохимической идентификации микроорганизмов. Эти тест-системы представляют собой пластины (панели), в лунках которых содержатся различные субстраты (рис.12.). Если микроорганизм способен утилизировать субстрат, то изменяется pH и индикатор вызывает изменение цвета среды. Таким образом, изменение цвета в лунках возникает вследствие метаболической активности микроорганизма (положительный результат). Отсутствие изменения цвета означает отрицательный результат (рис.12). Методом визуального сравнения испытуемых образцов с положительным контролем определяют способность бактерий ферментировать субстраты.

Таблица 3. Некоторые тесты для изучения биохимической активности бактерий.

Рис. 12. Биохимическая панель для идентификации бактерий. Ферментативный ряд E.coli.

Е. coli способна ферментировать сахарозу, глюкозу, лактозу и маннит, но не цитрат. Образует индол. Не обладает уреазной активностью

Кроме того, изучение биохимической активности может быть основано на измерении мутности стандартной бактериальной взвеси после её инкубации в лунках планшета с определёнными субстратами и может быть объединено (на одной планшете) с определением чувствительности к антибиотикам.

Результаты тестов оцениваются либо визуально, либо фотометрически (с использованием автоматических и полуавтоматических анализаторов).

2. Для определения антигенной структуры бактерий используются различные иммунохимические реакции (см. Главу 3). Вид или штамм, типированный с помощью специфических сывороток называют серотип/ серовар (от. англ. serum - сыворотка).

3. Чувствительность к бактериофагам (фаготипирование, определение фаготипа / фаговара) определяется по способности бактерий лизироваться определенными вирусами бактерий (фагами).