Конспекты / Сводки по темам / Принципы лаб диагностики_ПЦР

Принципы лабораторной диагностики инфекционных заболеваний

Основная цель микробиологического исследования – установить факт наличия или отсутствия возбудителя в организме больного и на объектах окружающей среды для постановки правильного диагноза инфекции. Кроме того, идентификация возбудителя необходима для назначения правильной антимикробной терапии. Наконец, лабораторный диагноз является инструментом эпидемиологического надзора и важен для контроля и предупреждения распространения инфекционных заболеваний.

Задачи микробиологического исследования:

1.Обнаружение патогенных микроорганизмов в исследуемом материале.

2.Идентификация патогенов с определением их видовой / штаммовой принадлежности.

Разработано много методических приемов выделения и идентификации МО. Эффективность работы в значительной степени обусловлена правильной техникой отбора образцов клинического материала, их правильном хранении и своевременностью доставки материала в лабораторию.

Основные правила взятия материала при проведении микробиологических исследований:

1.Отбирать материал желательно до начала проведения антимикробной терапии.

2.Материал получают в объеме, достаточном для всего комплекса исследований. Из очага поражения материал забирают без травматизации прилежащих тканей.

3.Отбор материала необходимо производить с соблюдением принципа стерильности (используют стерильные инструменты, помещают пробы в стерильный контейнер).

4.Тампоны с мазками помещают в транспортную среду или сохраняют во влажной атмосфере, т.к. при высыхании погибает большинство бактерий.

5.При подозрении на присутствие анаэробных микроорганизмов производят аспирацию отделяемого шприцем, для предотвращения контакта с кислородом воздуха.

6.Некоторые материалы (моча, фекалии, иногда гнойное отделяемое) можно сохранять в замороженном виде. Спинномозговую жидкость, кровь и другие тканевые жидкости замораживать нельзя. Образцы крови следует немедленно помещать в питательную среду.

7.Строго соблюдать время доставки и сроки исследования. Доставлять образцы в лабораторию необходимо не позднее шести (а в некоторых случаях - двух) часов после забора материала. Исследования следует начинать немедленно после поступления образца.

8.Необходимо соблюдать также правила личной биологической безопасности в течение забора, транспортировки, хранении, и работе с клиническим материалом. При попадании патогенного материала на кожу или слизистые оболочки, немедленно обработать их дезинфицирующим

раствором.

Клинические образцы могут быть разделены на две группы.

Первая группа - ткани, обычно стерильные в норме, например, кровь, костный мозг, цереброспинальная жидкость, моча, биопсийные ткани, материал вскрытия трупа, а также гной. Микроорганизмы, выделенные из этих тканей, являются несомненным возбудителем инфекционного заболевания.

Вторая группа образцов представляет собой материал, взятый из участков, обсемененных микрофлорой: верхний дыхательный тракт, слюна, желудочное содержимое, рвотные массы, фекалии, кожа и т.д. В этом случае необходимо помнить, что, наряду с патогенными микроорганизмами, нормальная флора также может являться возможным источником инфекции.

Основные направления (способы) лабораторной диагностики_инфекций

Существует три основных направления (способа) микробиологической диагностики инфекций: культуральный, экспресс-метод и иммунологический анализ.

1. Культуральный метод (бактериологический анализ, вирусологический, микологический)

Это наиболее надежный метод в лабораторной диагностике бактериальных инфекций и считается «золотым стандартом». Особенность метода - его многоэтапность Культуральный метод включает выделение и накопление чистой культуры бактерий с ее последующей идентификацией. Некоторые бактерии обладают антибиотикорезистентностью, поэтому бактериологический анализ может включать определение чувствительности выделенной чистой культуры к антибиотикам.

Недостатком культурального метода является лишь его длительность - необходимо 2-3 дня (иногда больше) для полной идентификации микроорганизма

Соблюдение стерильности является необходимым условием на каждом из этапов исследования, что минимизирует возможность загрязнения культуры организмами от окружающей среды или попадания микроорганизмов, особенно патогенных, в окружающую среду.

Для выделения чистой культуры бактерий используются плотные питательные среды: специальные, селективные или дифференциальные. Время культивирования зависит от вида микроорганизма. Большинство бактерий формируют видимые колонии через 18-24 часа (в то же время, для получения колоний микобактерий требуется 6 - 8 недель). После получения изолированных бактериальных колоний могут использоваться следующие методы для предварительной классификации

бактерий:

1. Морфологический анализ бактериальных колоний и их характеристика на специальных /дифференциальных средах. Некоторые родовые таксоны можно идентифицировать на основе морфологии их колоний; 2. Микроскопия окрашенных бактерий (окрашивание по методу Грама и др.)

Для окончательной идентификации бактерий требуется достаточное количество чистой культуры и анализ свойств бактерий, таких как: биохимическая активность, антигенная структура (серотипирование), чувствительность к бактериофагам.

Для культивирования вирусов используют клеточные культуры, куриные эмбрионы, а также чувствительных лабораторных животных После получения чистой культуры, вирусы могут быть идентифицированы с помощью специфических иммунных сывороток (серотипирование).

2. Экспресс-диагностика.

Экспресс-анализ основан на обнаружении МО или их компонентов непосредственно в клиническом материале. Данный метод не требует выделения чистой культуры.

Примеры.

Световая микроскопия. Прямая микроскопия - быстрый диагностический метод, но используется для идентификации ограниченного числа микроорганизмов. Необходимо, чтобы исследуемый материал не был значительно контаминирован сопутствующей микрофлорой.

Иммунофлюоресцентный анализ. Используется для обнаружения микробных антигенов в материале, при приготовлении мазка на стекле.

Обнаружение определенных последовательностей нуклеиновых кислот в исследуемом ма-

териале. В исследуемых образцах выявляют специфический фрагмент нуклеиновой кислоты (уникальную последовательность нуклеотидов) микроорганизмов. Данный способ помогает идентифицировать бактерии, не культивируемые, сложно культивируемые или медленно растущие на питательных средах, а также вирусы, склонные к персистенции Известны два метода для определения нуклеиновых кислот:

1)Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Основа метода – многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического

фрагмента ДНК, катализируемое ДНКполимеразой.

2) Методы гибридизации ДНК и РНК. Принцип метода основан на способности ДНК (иРНК) специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами искусственно созданных нитей ДНК (иРНК), меченных изотопами или ферментами (пероксидазой или щелочной фосфатазой). В дальнейшем образцы исследуют методом ИФА.

Газово-жидкостная хроматография. Обнаружение бактериальных жирных кислот, компонен-

тов клеточной стенки или бактериальных метаболитов.

3.Иммунологический метод ( серодиагностика)

Серодиагностика - обнаружение специфических антител (в сыворотке или других жидкостях пациента) к микроорганизму. Для серодиагностики используют различные иммунохимические тесты. Серодиагностика имеет несколько ограничений:

-концентрация АТ в организме мала на ранней стадии заболевания (в течение 1-й, начале 2-й недели), поэтому они могут быть не обнаружены на этом этапе.

-определение АТ не используется для установления оппортунистических инфекций, вызванных нормальной микрофлорой, поскольку АТ к таким бактериям всегда присутствуют в организме.

Серодиагностика может использоваться при невозможности или трудностях выделения микроорганизмов из патологического материала. Высокий титр антител может указывать на присутствие возбудителя в тканях хозяина. Титром реакции называют максимальное разведение сыворотки (минимальное количество в ней антител), дающее положительную иммунохимическую реакцию. Поскольку интенсивность образование антител к разным микроорганизмам не одинакова, поэтому титр реакции может отличаться при различных инфекциях.

В ряде случаев необходимо дифференцировать антитела, образующиеся в ответ на острую инфекцию, от остаточных антител от предыдущей инфекции или антител, образуемых после иммунизации. В этом случае, повышение титра (концентрации) антител в ходе заболевания, то есть количественная сероконверсия, может свидетельствовать об остром заболевании. Для определения нарастания титра антител в ходе острой инфекции используют реакцию с парными сыворотками ( . Первый образец сыворотки должен быть получен в начале заболевания, второй не ранее чем через 2 недели после первого. Одновременно ставят развернутую реакцию с двумя сыворотками (в различных разведениях). Существенное увеличение титра антител во второй сыворотке по сравнению с первой (в четыре раза или более для взрослых; в два раза или более для детей) является подтверждением остро протекающей инфекции.

Качественная сероконверсия. Изменение класса антител в ходе заболевания также помогает установить стадию болезни. Например, IgM, найденные в течение 2-3-й недели первичной инфекции указывают на недавнее начало инфекции. Таким образом, увеличение титра специфических IgG и присутствие IgM может подтверждать диагноз острой инфекции.

Полимеразная цепная реакция-ПЦР

ПЦР -это метод многократого увеличения (амплификации) числа копий любого фрагмента нуклеиновой кислоты. Это метод позволяет обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК или РНК в присутствии миллионов других молекул.

После 30-40 циклов амплификации образуется до 108 копий ДНК.

Применение ПЦР в диагностке инфекционных заб-й и эпидемиологических исследованиях:

9.Выявление трудно культивируемых м/о (например, микобактерии)

10.Ранняя диагностика возбудителя у серонегативных лиц

11.Выявление персистирующих, латентных и рецидивирующих форм инфекции

12.Выявление патогенных штаммов возбудителя

13.Эпидемиологические исследования, в том числе диагностика патогенов в пище. Материалом для исследования служат различные субстраты:

Достоинства ПЦР

14.Возможность использования различных биосубстратов для выявления возбудителей вирусных, бактериальных и грибковых инфекций

15.Высокая чувствительность (1 молекула ДНК)

16.Специфичность (праймеры и зонды комплементарны строго определенным участкам ДНК)

17.Производительность (возможность анализировать сотни образцов за раз)

18.Воспроизводимость получаемых результатов

19.ПЦР позволяет осуществлять диагностику не только острых, но и латентных инфекций

Недостатки ПЦР

20.Невозможность оценки источника происхождения ДНК возбудителя (живой микроорганизм или нет). Проблема выбора терапии.

21.Повышенная чувствительность метода (выявление ДНК условно-патогенных м/о, не всегда вызывающих заболевание)

Полимеразная цепная реакция.

Этапы амплификационного цикла:

а) Внесение в систему смеси свободных нуклеотидов (аденин, гуанин, тимин, цитозин) и материала, содержащего исследуемую ДНК.

b)Денатурация ДНК: расплетение двойной спирали ДНК (30-40 с при 93-95°С), получение отдельных цепочек ДНК (ДНКматрица).

c)Охлаждение среды до 50–65°С и внесение праймеров (генетических затравок). Праймеры присоединяются комплементарно только к соответствующим последовательностям на ДНК-матрице.

d)Внесение в среду термостабильной полимеразы, которая участвует в комплементарном достраивании второй нити на матрице ДНК (из имеющихся в среде свободных нуклеотидов). Образование вторичных копий двуспиральной ДНК.

После этого амплификационный цикл повторяется. Вновь полученные двуспиральные фрагменты ДНК снова подогреваются. Образующиеся отдельные цепочки остужают и вносят праймеры. Термостабильность полимеразы обуславливает ее устойчивость в циклах нагрева и охлаждения и отсутствие необходимости в его повторном внесении. Использование термостабильной ДНК-полимеразы позволило автоматизировать процесс амплификации с помощью специального прибора, называемого амплификатором. Этот прибор автоматически осуществляет смену температур, согласно за-

данной программе. После 30-40 циклов образуется до 108 копий ДНК. После чего проводят идентификацию ДНК методом электрофореза.

Модификации ПЦР

22.ОТ ПЦР. Предназначена для выявления фрагментов РНК. С помощью обратной транс-

криптазы на матрице РНК получают ДНК и лишь затем проводят амплификацию.

23.Мультиплексная ПЦР. Предназначена для одновременного выявления нескольких генетических фрагментов.

Например, набор для синхронного выявления ДНК Chlamydia trachomatis, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis.

24. Real-time ПЦР (RT PCR) или ПЦР в реальном времени. Применяется для количествен-

ной оценки изучаемых параметров (например, определение количества возбудителя). Real-time PCR

RT PCR может быть реализована в формате ОТ-ПЦР и мультиплексной ПЦР. Дополнительным компонентом, позволяющим в реальном времени отслеживать кинетику реакции является зонд – олигонуклеотид длиной 30 н.о., содержащий на одном конце флуоресцентный краситель (флуорофор), а на другом конце гаситель флуоресценции. Зонд гибридизуется на матрице раньше, чем праймеры.

Затем, в процессе элонгации полимераза разрушает зонд, высвобождая краситель, что приводит к усилению свечения.

Интенсивность свечения напрямую зависит от динамики гибридизации зондов поэтому можно количественно оценить присутствие искомого образца, а применяя разные флуоресцентные метки можно анализировать сразу несколько объектов.