Конспекты / Сводки по темам / Методы исследования вирусов-1
.pdf
II. ОБНАРУЖЕНИЕ ВИРУСОВ В ИНФИЦИРОВАННЫХ ОБЪЕКТАХ A. Микроскопия
Электронная микроскопия - наиболее чувствительный метод для изучения вирусных частиц (рис.1). Световая микроскопия может использоваться для
обнаружения вирионов натуральной оспы (рис. 1а). В процессе репродуктивного цикла, в местах компактной сборки вирусов формируются виропласты, которые состоят из синтезируемых вирусных частиц и компонентов клеток. Виропласты могут быть расположены в цитоплазме (например, у поксвирусов, вируса бешенства) или в ядре (герпесвирусы, аденовирусы). Крупные виропласты могут обнаруживаться как вирус-индуцированные включения при световой микроскопии (рис. 1b, 1c), что помогает при диагностике некоторых инфекционных заболеваний. Данные включения могут быть выявлены в окрашенных препаратах, притовленных из зараженной ткани, например цитоплазматические включения при бешенстве (эозинофильные тельца Бабеша-Негри) и при натуральной оспе (тельца Гварниери).
Рис.1. а) тельца Пашена (вирионы натуральной оспы) b) тельца Гварниери
c)тельца Бабеша-Негри.
B. Реакция гемадсорбции и гемагглютинации
Некоторые вирусы имеют поверхностные липопротеиновые комплексы – гемагглютинины в составе суперкапсида (например, вирус гриппа). Гемагглютинины вызывают склеивание эритроцитов животных разных видов. Для постановки реакции гемагглютинации часто используют пластиковые планшеты, лунки которых имеют малый размер и U-форму. Эритроциты склеиваются вирусными гемагглютининами и быстро образуют крупный осадок. Положительная реакция агглютинации (рис. 2b), выглядит как «перевернутый зонтик»
Рис. 2. Реакция гемагглютинации в лунках планшета: (а) контроль, (b) положительный результат;
Реакция гемадсорбции в культуре фибробластов (с).
по сравнению с контролем, проявляющимся как "пуговка" ("точка") - интактные эритроциты, осевшие на дно в центр лунки под действием силы тяжести (рис.16a). Если вирус, имеющий гемагглютинины, размножается в клеточной культуре, то гемагглютинины будут экспрессироваться на поверхности клеток в процессе репликации вируса. В этом случае, при добавлении в систему эритроцитов, они будут взаимодействовать с гемагглютининами и сорбироваться на поверхности вирус-инфицированных клеток. Данный феномен получил название гемадсорбция
(рис 2 с).
C. Цитопатический эффект вирусов
Некоторые вирусы вызывают морфологические изменения в клетках культур, в которых они культивируются. Эти изменения проявляются в изменении формы клеток, потере ядра, лизисе клеток, вакуолизации цитоплазмы,
образовании многоядерных клеток, и называются цитопатическими. Цитопатическое действие (ЦПД) вируса может быть обнаружено следующим образом:
1. Метод бляшек под агаром (метод Дюльбекко-Фохта). Обнаружение локального цитопатического эффекта.
Культуру клеток заражают вирусом и покрывают тонким слоем агара, для ограничения распространения вируса. После инкубирования посевов в течение нескольких суток на агаровом покрытии появляются просветленные участки определенной формы (бляшки), представляющие собой участки погибших клеток в сплошном монослое
клеточной культуры (рис. 3).
Рис. 3. Колонии (бляшки) вирусов полиомиелита в клеточной культуре
Подсчет бляшек производят через 2-3 суток. Каждая бляшка образуется при размножении одной вирусной частицы. Поэтому данный метод используют также для количественного учета отдельных вирусных частиц. Метод Дюльбекко-Фохта используют для обнаружения цитопатического действия энтеровирусов. По характеру, величине, фор ме, размеру "бляшек" можно дифференцировать энтеровирусы между собой. Полиовирусы и вирусы ЭСНО образуют "бляшки" круглые с четкими границам, вирусы Коксаки В вызывают "бляшкообразование" более поздно, края их размыты.
2. Разрушение монослоя клеточной культуры в пробирке можно обнаружить
при микроскопическом исследовании (рис.4b). Под микроскопом будут видны только отдельные разрозненные клетки (клеточный монослой разрушен).
3. Обнаружение симпластов (многоядерных клеток).
Некоторые вирусы, например, респираторно-синцитиальный вирус, способны стимулировать слияние клеточных мембран без разрушения клетки, что приводит к образованию гигантских многоядерных клеток. Такие клетки называются симпласт, или синцитий (рис. 4c).
Рис. 4. а) однослойная культура клеток; b) разрушение клеток полиовирусом, обладающим выраженным цитопатическим эффектом; с) образование симпласта под действием респираторно-синцитиального вируса.
4. Цветная проба (ингибирование метаболической активности) ставится в пробирках с культурами клеток человека. Жидкая питательная среда для культивирования клеток содержит индикатор рH (феноловый красный). Контрольная пробирка имеет красный цвет среды (рис. 5а.). Вследствие метаболизма культуры клеток происходит закисление среды, и индикатор изменяет цвет среды на желтый (рис. 5b). Вирус, обладающий цитопатическим действием (ЦПД), вызывает гибель клеток, выделения продуктов клеточного метаболизма не происходит, цвет среды остается красным (рис. 5c).
Рис. 5. Цветная проба для определения цитопатического эффекта вируса полиомиелита.