Конспекты / Сводки по темам / МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ И ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ

Антибиотики – это продуцируемые микроорганизмами (актиномицетами, бактериями, грибами) вещества, способные избирательно убивать другие микроорганизмы (в отношении бактерий - бактерицидный эффект) или подавлять их рост и размножение (бактериостатический эффект) без вреда для клеток макроорганизма (хозяина). В большинстве случаев подобная избирательная токсичность относительна. Эффективная этиотропная терапия заключается в использовании концентрации антибиотика, достаточной для гибели микроорганизма и безвредной для человека. В современный период широкого и интенсивного применения антибиотиков резко возросла циркуляция микроорганизмов с приобретенной антибиотикорезистентностью. Только точное определение чувствительности к антибиотикам каждого конкретного возбудителя инфекции (штамма) может обеспечить правильный выбор препарата для терапии.

Антибиотики природного происхождения (или искусственно синтезированные, но имеющие структурные аналоги природного происхождения) принято отличать от химиотерапевтических препаратов - изначально синтетических соединений (сульфаниламиды, нитрофураны, хинолоны, фторхинолоны). Однако принципиальных различий в антибактериальном действии у данных групп нет. Антибиотики и химиопрепараты действуют как антиметаболиты, т.е. нарушают метаболизм живых бактериальных клеток. Поэтому данные препараты не действуют на покоящиеся формы бактерий (споры, элементарные тельца микоплазм). После выделения чистой культуры, чувствительность данного штамма бактерий к антибиотикам может быть определена диско-диффузионным методом и методом серийных разведений. Чувствительность к антибиотикам также можно определить, если обнаружить у бактерий специфичекие гены (последовательности ДНК), определяющие резистентость к определенным антибиотикам. Так, например, с помощью полимеразной цепной реакции (см. Главу 3) могут быть выявлены метициллин-резистентные штаммы бактерий.

A.Диско-диффузионный метод

Данный метод следует рассматривать как качественный. Благодаря простоте использования он является основным для практических лабораторий. В чашку Петри засевают сплошным газоном исследуемую чистую культуру (рис.13). Затем на поверхность среды накладывают пинцетом диски с антибиотиками (на равном расстоянии друг от друга и на 2 см от края чашки, 5-6 дисков на чашку). Чувствительность к антибиотикам определяют после инкубирования в термостате (37°С, 18-24 часа), измеряя линейкой зону задержки роста вокруг дисков. Размер зоны задержки роста коррелирует с чувствительностью микроорганизма к антибиотику. Оценку результатов проводят по таблице в соответствии с используемой средой и видами бактерий. Микроорганизмы могут быть чувствительны (в зависимости от химической группы антибиотика диаметр прозрачной зоны задержки роста может быть 15-25 мм и больше), умеренно чувствительны или устойчивы (отсутствие зоны задержки роста) к препарату.

Рис. 13. Диско-диффузионный метод

а) чашка Петри с питательной средой

b)методом сплошного газона засевают испытуемую культуру

c)наносят диски с антибиотиками

d)измеряют зону задержки роста бактерий вокруг дисков с антибиотиками через 18-24 ч

B.Метод серийных разведений.

Это более точный количественный метод исследования, его используют в особо важных практических случаях и научно-исследовательской работе. Разведения антибиотиков готовят путем разбавления основного раствора антибиотика бульоном в диапазоне, определенном критериями антибиотикочувствительности. Например, для двукратных разведений антибиотика в диапазоне от 0,25 до 4 ЕД/мл (U/ml) используют 6 пробирок, в которые, кроме первой пробирки, вносят по 1 мл бульона (рис. 14). В первую пробирку вносят 2 мл раствора антибиотика с концентрацией 4 ЕД/мл. Затем отдельными пипетками переносят по 1 мл раствора антибиотика из первой пробирки в каждую последующую. Таким образом, концентрация антибиотика в пробирках последовательно уменьшается. Из предпоследней пробирки 1 мл смеси удаляют, в последнюю пробирку антибиотик не добавляют (контроль). Испытуемые микроорганизмы вносят по 1 мл во все пробирки с разведениями антибиотика и в контрольную. Посевы инкубируют при 37°С до появления роста в контроле. Отмечают первую пробирку с задержкой роста микробов. Содержание антибиотика (ЕД/мл) в этой пробирке является для испытуемого штамма минимальной ингибирующей концентрацией (МИК). На следующем этапе из всех пробирок с антибиотиком, в которых отсутствует визуально рост бактерий (но могут содержаться живые бактерии), делают высев по 0,1 мл на отдельные чашки Петри с питательной средой (субкультивирование) и инкубируют при 37°С 18-24 ч. Определяют минимальную бактерицидную концентрацию антибиотика (МБК) по первой пробирке с антибиотиком, высев из которой не дал роста колоний бактерий на чашке. Для выявления толерантности бактерий к антибиотику определяют отношение МИК к МБК. Испытуемый штамм бактерий считается толерантным (нечувствительным) к антибиотику, если это отношение ³32. Метод разведения позволяет дифференцировать антибиотики бактерицидные, которые убивают микроорганизмы, и бактериостатические, которые только замедляют их рост.

Рис. 14. Определение минимальной ингибирующей (MИК) и минимальной бактерицидной концентрации (MБК) антибиотика.

Пробирка с наименьшей концентрацией антибиотика без видимого роста содержит МИК антибиотика. Пробирка, с наименьшей концентрацией антибиотика, из которой не высеялись бактерии, содержит МБК антибиотика.

С. Автоматизированные (ускоренные) методы

Ускоренное определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам возможно при использовании автоматизированных систем для микробиологических исследований (например, MS-2, Quantum 2, Sceptor и др.). В лунках планшетов (панелей) могут содержаться субстраты и антибиотики. Каждый антибиотик представлен в одной концентрации. Одновременно тестируется 20 и более антибиотиков. После внесения взвеси испытуемых бактерий посевы инкубируют при 35-37°С в течение 4-5 ч. Результаты регистрируют спектрофотометрически сразу при размножении бактерий в контроле без антибиотика.

Кроме того, возможно использование полимеразной цепной реакции (см.: ГЛАВА 4) для обнаружения у бактерий специфических генов (последовательностей ДНК), определяющих резистентность микроорганизмов к антибиотикам.