13. Условия, необходимые для культивирования микроорганизмов в бактериологической лаборатории.

СМ ТЕТРАДЬ

Условия культивирования микроорганизмов Для роста микроорганизмов существенное значение имеют не только состав питательной среды, но и такие факторы, как кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти пределы часто не одинаковы. Активная кислотность среды (рН) имеет решающее значение для роста многих микроорганизмов. Большинство бактерий лучше всего растет при рН, близком к 7,0, напротив, микроскопические грибы предпочитают слабокислые среды. Поэтому в приготовленных средах всегда следует определить значение рН. Значение рН сред может измениться в процессе стерилизации, поэтому после стерилизации его следует проверить и довести до нужного, если это требуется, стерильными растворами кислоты или щелочи. В процессе культивирования микроорганизмов кислотность питательной среды часто меняется. Эти изменения могут быть результатом образования продуктов метаболизма или неравномерного потребления отдельных компонентов среды. Поддержание определенного значения рН во время роста особенно важно для тех микроорганизмов, которые образуют в процессе жизнедеятельности кислоты, но не обладают устойчивостью к ним. К их числу относятся мол очно-кислые бактерии, а также многие псевдомонады. Аэрация. По типу дыхания бактерии разделяют на 4 группы:

а) облигатные, или строгие, аэробы, которые могут расти только при наличии кислорода;

б) микроаэрофилы, которые нуждаются в кислороде, но лучше растут при парциальном давлении О2 меньшем, чем в воздухе;

в) факультативные анаэробы, которые способны расти как в присутствии, так и в отсутствии молекулярного кислорода (например, некоторые дрожжи или энтеробактерии в зависимости от наличия кислорода осуществляют аэробное дыхание или брожение;

г) облигатные анаэробы (клостридии ботулизма, газовой гангрены, столбняка, бактероиды и др.) растут только на среде без кислорода, который для них токсичен. Неодинаковые потребности микроорганизмов в свободном кислороде определяют различия и в способах их культивирования. Температура. Интервалы температур, в которых возможен рост различных микроорганизмов, заметно варьируются. У мезофилов, к которым относится большинство известных бактерий, температурный оптимум ле35 жит в интервале 25 – 37 °С. У термофилов он значительно выше – от 45 до 80 – 90 °С. Психрофилы хорошо развиваются в интервале температур 5 – 10 0С. Отклонения температуры от оптимальной неблагоприятно влияют на развитие микроорганизмов.

14. Классификация бактерий по типу дыхания. Методы культивирования бактерий в зависимости от типа дыхания.

СМОТРИ ТЕТРАДЬ

15.Рост и размножение бактерий. Фазы размножения

Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом — фор­мированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, а также размноже­нием — самовоспроизведением, приводящим к увеличению ко­личества бактериальных клеток в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтези­рующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные — путем перетяжки, в результате образования гантелевидных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хро­мосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной ни­тью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра — нуклеоида.

Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элонгация, или рост цепи, и терминация.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питатель­ной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и пре­кращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой си­стеме называют периодическим культивированием, а культуру — периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивиро­вание называется непрерывным, а культура — непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов:

1. лаг-фаза;

2. фаза логарифмического роста;

3. фаза стационарного роста, или максимальной концентрации бактерий;

4. фаза гибели бактерий.

Эти фазы можно изобразить графически в виде отрезков кри­вой размножения бактерий, отражающей зависимость логариф­ма числа живых клеток от времени их культивирования.

• Лаг-фаза — период между по­севом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы в среднем 4—5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в раз­мерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеино­вых кислот, белка и других компонентов.

• Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом ин­тенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5— 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20—40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ра­нимы, что объясняется высокой чувствительностью компонен­тов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др.

• Затем наступает фаза стационарного роста, при которой количество жиз­неспособных клеток остается без изменений, составляя макси­мальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность вы­ражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования.

• Завершает процесс роста бактерий фаза гибели, характеризующаяся отмиранием бак­терий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжи­тельность ее колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интен­сивность роста и размножения бактерий зависит от многих фак­торов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.

Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолирован­ные колонии округлой формы с ровными или неровными кра­ями (S- и R-формы), различной консистенции и цве­та, зависящего от пигмента бактерий. Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питатель­ную среду и окрашивают её. Другая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в орга­нических растворителях. И, нако­нец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях.

16.Методы создания анаэробных условий культивирования микроорганизмов: физический, химический, биологический. Этапы выделения чистой культуры анаэробов. Питательные среды, используемые при культивировании анаэробов.

Физические методы основаны на создании вакуума в специальных аппаратах — анаэростатах. Иногда воздух в них заменяют каким-либо другим газом, например СО2. Доступ кислорода в питательную среду можно затруднить, если культивировать анаэробов в глубине столбика сахарного агара или среды Вильсона — Блера, налитых в пробирки в расплавленном состоянии и остуженных до 43°С. По методу Вейона — Виньяля расплавленный и остуженный агар с посевным материалом набирают в стеклянные трубочки, которые запаивают с двух концов.

Химические методы заключаются в том, что при культивировании исследуемого материала на плотных средах в эксикатор помещают химические вещества

Биологический метод основан на одновременном культивировании аэробов и анаэробов на плотных питательных средах в чашках Петри, герметически закупоренных. Вначале кислород поглощается растущими аэробами, посеянными на одной половине среды, а затем начинается рост анаэробов, посев которых сделан на другой половине.

Наиболее удобна для культивирования анаэробов специальная среда Китта — Тароцци. В нее входят сахарный МПБ, который наливают в пробирки в количестве 10—12 мл, и кусочки вареных паренхиматозных органов. Перед употреблением среду Китта ,— Тароцци кипятят на водяной бане для удаления растворенного в ней кислорода. Среду заливают сверху стерильным вазелиновым маслом. Заметный рост анаэробов (помутнение) может наблюдаться через 48 ч и более в зависимости от количества посевного материала.

Методы выделения чистых культур анаэробов.

Метод Цейсслера. Исследуемый материал сеют штрихами по поверхности плотной среды. Создают анаэробные условия. И инкубируют при 37 градусах 24-72ч. Изолированные колонии анаэробов пересевают на среду контроля стерильности или среду Китта-Тароцци.

Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материал вносят в пробирку с 4-5мл изотонического раствора. Перемешивают запаянным капилляром переносят в пробирку с охлажденным до 45-50 градусов сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают под струей воды. Выросшие в глубине колонии пересевают на СКС или среду Китта-Тароцци.

Среда Тукаева (для анаэробных микроорганизмов). К 1% пеп- тонной воде добавляют 5—6% обезжиренного молока.

Среда Вильсона — Блера (для анаэробных микроорганизмов). 100 мл 3% МПА с 1% глюкозы растапливают в водяной бане и добавляют 10 мл 20% раствора сульфида натрия и 1 мл 8% раствора хлорида железа. Оба раствора готовят на стерильной дистиллированной воде и кипятят. Среду разливают в пробирки по 7 мл и используют в расплавленном виде при 45°С для посева исследуемого материала на выделение анаэробов.

17. Значение дифференциально – диагностических питательных сред в идентификации различных видов микроорганизмов. Биохимические свойства бактерий. Методы изучения сахаролитических и протеолитических ферментов.

Дифференциально-диагностические среды применяются для быстрой идентификации близкородственных видов микроорганизмов, для определения видовой принадлежности, в клинической бактериологии и т.д. Принцип построения таких сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности и имеют неодинаковый набор ферментов, расщепляющих субстраты, входящие в состав питательной среды. В состав дифференциально-диагностической среды входят:

а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий;

б)определенный химический субстрат, отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроорганизма;

в) цветной индикатор, изменение окраски которого свидетельствует о биохимической реакции и наличии данной ферментной системы у исследуемого микроорганизма. Например, среда Левина в качестве индикаторов содержит эозин и метиленовый синий, исходно окрашена в черно-синий цвет. Клетки, осуществляющие брожение, образуют колонии, окрашенные в черный с металлическим блеском цвет, а колонии, не обладающие этим свойством, бесцветны. Данная среда позволяет отличать бактерии рода Escherichia от бактерий рода Proteus. Для этой же цели на практике часто используют среду Эндо.

В жизнедеятельности микробов ферменты играют большую роль. Они являются обязательными участниками разнообразных биохимических реакций, лежащих в основе функций питания, дыхания, размножения. По характеру связи с цитоплазменными структурами и по месту проявления своего действия ферменты делятся на внутри- и внеклеточные. Каждый вид микроорганизмов продуцирует постоянный для него набор ферментов, одни из которых расщепляют в разной степени белки и углеводы, а другие вызывают окисление и восстановление различных субстратов.

Стабильность ферментативных систем бактерий позволяет использовать биохимические свойства бактерий в сочетании с их морфологическими, культуральными и другими постоянными признаками для определения видов и типов бактерий.

Для обнаружения ферментов исследуемую культуру микробов засевают на специальные дифференциально-диагностические питательные среды

Сахаролитические ферменты микробов. Свойство расщеплять углеводы и высокоатомные спирты, которые принято объединять в одну группу, именуемую сахарами, присуще многим патогенным микробам. Под действием сахаролитических ферментов бактерий сахара расщепляются на альдегиды и кислоты. Конечными продуктами их расщепления являются газообразные веществ

Протеолитические ферменты микробов. Некоторые виды микроорганизмов продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты — протеазы, катализирующие расщепление белков. В результате расщепления молекулы белка образуются высокомолекулярные промежуточные продукты распада — пептоны, альбумозы и полипептиды. Под действием других протеолитических ферментов пептоны в свою очередь расщепляются на полипептиды (соединения двух или нескольких аминокислот) и отдельные аминокислоты.

Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру микроба засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок. Чаще всего для этой цели применяют желатин, реже — свёрнутую лошадиную сыворотку, коагулированный яичный белок, молоко или кусочки вареного мяса.

Протеолитическая активность одного и того же микроба при определении ее на разных питательных средах будет проявляться неодинаково, что обусловлено специфичностью ферментов. Поэтому для разных видов микробов рекомендуют питательные среды различного состава.

Аналогичным образом проявляются протеолитические свойства микробов в средах с кусочком вареного мяса.

Некоторые виды патогенных микробов с выраженной протеолитической активностью обладают способностью расщеплять белок и пептон до продуктов глубокого распада индола, сероводорода, мочевины и аммиака.

Реакция на аммиак. Применяют полоску фильтровальной бумаги пропитанной индикатором. При положительном результате бумага синеет.

Реакция на индол. Способ Эрлиха: в пробирку с культурой бактерий добавляют несколько капель реактива Эрлиха. В присутствии индола на поверхности появляется розовое кольцо.

Реакция на сероводород. Можно использовать фильтровальную бумагу с сульфатом железа. При выделении сероводорода бумага окрашивается в черный цвет.

Обнаружение каталазы. На предметное стекло наносят 1-2 капли раствора пероксида водорода и вносят нее петлю с исследуемой культурой. Выделение пузырьков газа свидетельствует о наличии каталазы

Определение сахаролитической активности.

Определение биохимической активности с помощью посева на среды «пестрого ряда». Пестрый ряд Гисса содержит обычно 5 пробирок с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой и сахарозой. При некоторых исследованиях для более углубленного изучения биохимических свойств выделенного микроба ряд Гисса дополняют дульцитом, сорбитом, ксилозой, арабинозой и некоторыми другими сахарами.

Название пестрый ряд обусловлено тем, что под действием ферментов микроба одни углеводы остаются неизменными и, следовательно, цвет питательной среды не меняется, в то время как другие сахара расщепляются, образуя кислые продукты распада, которые изменяют цвет индикатора и соответственно цвет питательной среды.

Определение биохимической активности на среде Клиглера.

Среда Клиглера предназначена для определения ферментации глюкозы, лактозы, выделения сероводорода и выделения газа. Разливается в пробирки и скашивается наполовину. Незасеянная среда Клиглера имеет красный цвет. Если после инкубации скошенная часть среды меняет цвет с красного на желтый, происходит ферментация лактозы, если столбик агара меняет цвет с красного на желтый – происходит ферментация глюкозы. Если в столбике агара наблюдается почернение – выделяется сероводород и происходит ферментация глюкозы. Если в среде наблюдаются пузырьки газа, следовательно в процессе ферментации выделяется газ

Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью сред "пестрого ряда".

1.Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают петлей в среды "пестрого ряда".

2.Посевы инкубируют при 37° С в течение 18—24 ч или больше.

3.В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды;

4.При разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляется пузырек газа в поплавке.

5.Если используют среды с полужидким агаром, то образование газа регистрируется по разрыву столбика. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют "пестрым рядом».