- •1. Мембранные технологии, их использование в биотехнологии.
- •1. Пластинчатый диализатор
- •2. Диализатор типа «фильтр-пресс»
- •2. Роль мембранных технологий в очистке генно-инженерных белков.
- •1. Ультрафильтрация
- •2. Диализ
- •3. Электродиализ
- •3. Предложить вариант мембранной технологии для концентрирования большого количества раствора генно-инженерного белка
- •1. Ультрафильтрация: Первичный этап концентрирования
- •2. Диализ: Удаление остаточных солей и буферных компонентов
- •3. Электродиализ: Регулировка ионного состава
- •4. Центрифугирование, основные методы.
- •1. Этапы применения центрифугирования
- •1.1. Удаление клеточного мусора (клеточный лизат)
- •1.2. Концентрация белка
- •Тип ротора:
- •Условия центрифугирования:
- •Особенности
- •Виды колориметрии
- •Пример работы фотоколориметра
- •Строение и принцип работы спектрофотометра на диодной матрице:
- •Преимущества и особенности:
- •1. Поглощение белков в уф-области
- •2. Поглощение нуклеиновых кислот (нк) в уф-области
- •3. Изобестическая точка
- •Применение в бт:
- •1. Ультрафиолетовая видимая спектроскопия (uv-Vis)
- •1. Источник инфракрасного излучения
- •2. Монохроматор
- •3. Оптическая система
- •4. Образец
- •5. Приемники излучения
- •Принцип работы
- •Особенности и преимущества Фурье-ик-спектрометра
- •1. Инфракрасная (ик) спектроскопия Описание метода:
- •Применяемые техники:
- •Применение:
- •2. Раман-спектроскопия (спектроскопия комбинационного рассеяния) Описание метода:
- •Применяемые техники:
- •3. Спектроскопия комбинационного рассеяния ближнего ик-диапазона (nir-спектроскопия)
- •Применение флуоресценции в биотехнологии
- •Тушение флуоресценции
- •Иммунофлуоресценция
- •Основные элементы устройства
- •Импульсные спектрометры с преобразованием Фурье (ft-nmr)
- •Основные этапы maldi масс-спектрометрии:
- •1. Время удерживания:
- •2. Время удерживания несорбируемого компонента или мертвое время:
- •3. Мертвый объём
- •4. Фактор удерживания к (коэффициент ёмкости)
- •5. Селективность (α):
- •6. Эффективность - число теоретических тарелок
- •7. Высота теоретической тарелки (h):
- •8. Пиковая емкость колонки
- •9. Разрешение Rs:
- •10. Фактор асимметрии для Асимметричные пики («с хвостом»)
- •1. Экстракция водорастворимых биологически активных соединений
- •2. Экстракция жирорастворимых биологически активных соединений
- •1. Лиофильные сушилки (фриз-драйеры)
- •Принцип действия:
- •2. Ротационные испарители
- •3. Сушильные шкафы
- •2. Спрей-сушилки (распылительные сушилки)
- •3. Вакуумные сушилки Принцип действия:
- •Применение:
- •1) Источники питания
- •38.Сравнительный анализ хроматографических и электрофоретических задач в биотехнологии.
- •2. Типы анализируемых веществ:
- •5. Оборудование и сложность:
- •40. Капиллярный электрофорез, особенности и достоинства метода в сравнении с планарным электрофорезом.
1. Этапы применения центрифугирования
1.1. Удаление клеточного мусора (клеточный лизат)
После разрушения клеток (например, с помощью ультразвука, осмотического шока, детергентов или механической гомогенизации) образуется смесь, содержащая:
Генно-инженерный белок.
Клеточный мусор (мембраны, органеллы, ДНК, РНК).
Цель: Очистить супернатант от крупных частиц.
Процесс:
Используется низкоскоростное центрифугирование (3,000–10,000 g) в течение 15–30 минут.
Осадок (мембраны и крупный мусор) удаляется, супернатант содержит белок и растворимые примеси.
1.2. Концентрация белка
На этом этапе нужно уменьшить объем раствора, увеличив концентрацию белка.
Методы:
Ультрафильтрация: Используются центрифужные фильтры с мембранами, пропускающими растворитель и мелкие молекулы, но задерживающими белок.
Осаждение белков: С использованием веществ, таких как аммоний сульфат или органические растворители, белки осаждаются и концентрируются при центрифугировании.
1.3. Удаление остатков нуклеиновых кислот
После очистки клеточного лизата могут оставаться ДНК и РНК, которые нужно удалить.
Процесс:
Добавление ДНКазы/РНКазы и последующее центрифугирование осаждает комплексы нуклеиновых кислот с белками.
Супернатант становится чище.
1.4. Дифференциальное центрифугирование
Для разделения белков на основе их плотности и размера можно использовать несколько циклов центрифугирования с возрастающими скоростями.
Пример:
При скорости 20,000–50,000 g можно разделить белки различной молекулярной массы.
1.5. Градиентное центрифугирование
Используется для более тонкого разделения белков.
Методы:
Сахарозный градиент: Белки мигрируют к положению, где их плотность равна плотности среды.
Градиент солей (CsCl, NaCl): Для разделения белков с различной плотностью.
2. Преимущества центрифугирования в очистке белков
Высокая эффективность: Быстрое удаление клеточного мусора и растворимых примесей.
Селективность: Возможность концентрировать и разделять белки по молекулярной массе и плотности.
Минимизация денатурации: Поддержание температуры (например, +4 °C) и оптимальных условий буфера
3. Интеграция с другими методами очистки
Центрифугирование часто используется в комбинации с другими методами:
Хроматография: После удаления крупного мусора белок очищают с помощью аффинной, ионообменной или гель-фильтрационной хроматографии.
Диализ: Для удаления низкомолекулярных примесей после концентрации белка.
6. Предложить вариант центрифугирования для концентрирования большого количества раствора генно-инженерного белка.
Для концентрирования большого количества раствора генно-инженерного белка можно предложить следующий вариант центрифугирования: