1. Ультрафильтрация: Первичный этап концентрирования

• Цель: Уменьшение объема раствора за счет удаления воды и низкомолекулярных примесей (солей, буферных компонентов).

• Конфигурация системы:

  • Ультрафильтрационная установка с полупроницаемыми мембранами (MWCO, соответствующее размеру белка).

  • Используется режим тангенциального потока (TFF) для предотвращения засорения мембран.

• Параметры:

  • Трансмембранное давление: 1–5 бар.

  • Температура: 4–25 °C.

  • Буфер: стабилизирующий белок, минимизирующий агрегацию.

• Преимущества:

  • Быстрое снижение объема раствора.

  • Минимальный риск потери белка.

2. Диализ: Удаление остаточных солей и буферных компонентов

• Цель: Очистка концентрата от низкомолекулярных соединений, таких как соли и метаболиты.

• Процесс:

  • Используются полупроницаемые мембраны, помещенные в буферный раствор.

  • Концентрационный градиент обеспечивает диффузию примесей через мембрану.

  • Буферный раствор периодически обновляется для поддержания градиента.

• Конфигурация:

  • Диализатор с высокой площадью мембраны для обработки больших объемов.

  • Буфер подбирается с учетом стабильности белка.

• Особенности:

  • Медленный процесс, но с высокой селективностью.

  • Мягкие условия сохраняют белок активным.

3. Электродиализ: Регулировка ионного состава

• Цель: Удаление избыточных ионов или регулировка pH в концентрате белка.

• Принцип:

  • Раствор пропускается через мембранные ячейки, чередующиеся с анионо- и катионообменными мембранами.

  • Электрическое поле заставляет ионы перемещаться к соответствующим электродам, снижая их концентрацию в растворе.

• Применение:

  • Удаление остаточных солей, стабилизирующих растворов или нежелательных ионов.

  • Подготовка раствора для конечного использования (например, в фармацевтическом производстве).

• Параметры:

  • Контролируемый уровень pH.

  • Температура: 4–20 °C для предотвращения инактивации белка.

• Преимущества:

  • Высокая точность в удалении ионов.

  • Регулировка pH без добавления химических реагентов.

Схема процесса

1. Ультрафильтрация → Концентрация раствора до 10–30% от начального объема.

2. Диализ → Удаление низкомолекулярных примесей, поддержание стабильности белка.

3. Электродиализ (при необходимости) → Финальная корректировка ионного состава, удаление остаточных солей.

4. Центрифугирование, основные методы.

Центрифугирование (от центр и лат. fuga — бегство, бег), разделение неоднородных систем под действием центробежных сил. Мы имеем дело с жидкостными системами – суспензиями (смесь веществ, где твёрдое вещество распределено в виде мельчайших частичек в жидком веществе во взвешенном (неосевшем) состоянии. Обычно размер частиц > 10 мкм) и эмульсиями (дисперсная система с жидкой дисперсионной средой и жидкой дисперсной фазой. Эмульсии состоят из несмешиваемых жидкостей).

Скорость осаждения, или седиментации, зависит от центробежного ускорения (G), прямо пропорционального угловой скорости ротора (ω, в рад/с) и расстоянию между частицей и осью вращения (К, в см) G = ω²γ

Угловая скорость ротора в оборотах в минуту N(об./мин)

ω =2πΝ/60=πΝ/30

Центробежное ускорение (об. /мин)

G =π²Ν²r/900

Центробежное ускорение обычно выражается в единицах g и называется относительным центробежным, ускорением

ОЦУ= G / g

g = 9,80665 м/с2

Время седиментации в результате зависит от

1. Разности плотностей частицы и окружающей среды

2. Размера частицы

3. Формы частицы (стоксов радиус)

Препаративное центрифугирование

o Аналог фильтрования

o Разделение объектов

Аналитическое

o Молекулярные веса

o Изучение конформаций макромолекул

Методы центрифугирования: Дифференциальное; Зонально-скоростное; Изопикническое

Дифференциальное центрифугирование - Препаративный метод, наиболее часто используется как аналог фильтрации, разделение сильно отличающихся компонентов.

Смесь помещается в центрифугу, где более крупные и плотные частицы осаждаются быстрее.

После центрифугирования образуется осадок (пеллет) и надосадочная жидкость (супернатант), которые разделяются.

Зонально-скоростное центрифугирование- Частицы разделяются в градиенте плотности среды в зависимости от их скорости седиментации.

• Процесс:

  • Градиент плотности (например, сахарозы или перколла) создаётся в пробирке.

  • Смесь наносится поверх градиента, и при центрифугировании частицы мигрируют на определённые расстояния, соответствующие их седиментационным коэффициентам.

  • В конце процесса частицы остаются в различных зонах, разделённых по размеру и плотности.

• Применение:

  • Разделение сложных биологических смесей, таких как белки, нуклеиновые кислоты, вирусы.

  • Используется для более точного разделения, чем дифференциальное центрифугирование.

Плотность начальной точки градиента подбирается так, чтобы плотность пробы была меньше – это позволяет наслаивать пробу без смешивания. (см. коктейль Bloody Mary)

Градиент плотности играет вспомогательную роль – препятствует конвекционному размыванию разделяемых зон. Важно не «перекрутить» и не перейти в дифференциальный режим!

Изопикническое центрифугирование - Частицы распределяются в градиенте плотности в точке, где их плотность равна плотности среды.

Процесс:

• Смесь вводится в подготовленный градиент плотности (CsCl₂), градиент образуется во время центрифугирования.

• Частицы мигрируют к зоне, где их плотность совпадает с плотностью среды.

• После завершения центрифугирования частицы остаются в своих равновесных позициях.

Применение:

• Разделение компонентов на основе различий в плотности, например, изолирование ДНК, РНК или органелл.

• Обеспечивает высокую степень разделения.

Градиент плотности играет основную роль – разделение по плотностям.

В данном методе идёт разделение только и именно по плотностям. Размеры не имеют значения.

На рисунке – важен цвет, обозначающий плотность. В случае В – градиент плотности формируется из-за противоположно действующих сил (центробежная сила и диффузия)

Виды центрифуг

Препаративные центрифуги

Центрифуги общего назначения o 8000 об./мин o ОЦУ до 6000 g.

Скоростные центрифуги o 25 000 об/мин o ОЦУ до 89 000 g

Препаративные ультрацентрифуги o 75 000 об./мин o ОЦУ до 510 000 g

Определение молекулярных весов

По скорости седиментации

Константа седиментации это скорость, отнесенная к единице ускорения, имеет размерность времени (ее выражают в секундах). Величина константы седиментации, равная 1•10^–13 с, условно принята за единицу и названа сведбергом (S). Значения констант седиментации большинства белков лежат в пределах 1–50 S, хотя в ряде случаев эти значения превышают 100 S.

Молекулярный вес молекул определяют по уравнению Сведберга

М — молекулярный вес молекулы, R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура, s — коэффициент седиментации молекулы, D — коэффициент диффузии молекулы, v — парциальный удельный объем, который можно рассматривать как объем, занимаемый одним граммом растворенного вещества, ρ — плотность растворителя.

Метод седиментационного равновесия

Ультрацентрифугирование проводят вплоть до достижения частицами равновесия, устанавливающегося под действием центробежных сил, с одной стороны, и диффузионных — с другой, т. е. до тех пор, пока частицы не перестанут перемещаться. Затем по образовавшемуся градиенту концентрации рассчитывают молекулярный вес вещества согласно формуле

R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура, ω — угловая скорость, ρ — плотность растворителя, ν — парциальный удельный объем, с1 и с2— концентрация растворенного вещества на расстояниях r1 и r2 от оси вращения

Недостатком данного метода является то, что для достижения седиментациоиного равновесия необходимо длительное время — от нескольких дней до нескольких недель при непрерывной работе центрифуги.

Метод приближения к седиментационному равновесию

Этот метод был разработан для того, чтобы избавиться от недостатков предыдущего метода, связанных с большими затратами времени, необходимого для установления равновесия. С помощью него можно определять молекулярные веса, когда центрифугируемый раствор находится в состоянии приближения к равновесию. Вначале макромолекулы распределяются по всему объему аналитической ячейки равномерно; затем по мере центрифугирования молекулы оседают, и плотность раствора в области мениска постепенно уменьшается. Изменение плотности тщательно регистрируют, а затем путем сложных расчетов, включающих большое число переменных, определяют молекулярный вес данного соединения по формулам.

Методы формирования градиента

1. Ступенчатый градиент - Градиент создается путем последовательного слияния растворов с разной плотностью.

• Процесс:

  • Растворы с возрастающей плотностью аккуратно накладываются друг на друга (слои).

  • Слоение выполняется с использованием пипеток или автоматических систем, чтобы минимизировать смешивание слоев.

• Особенности:

  • Градиент имеет четко выраженные границы между слоями.

  • Подходит для разделения крупных частиц или объектов с большими различиями в плотности.

• Применение:

  • Используется для изопикнического разделения, например, клеток или органелл.

2. Метод сообщающихся сосудов-Градиент формируется естественным образом под действием силы тяжести в сообщающихся сосудах.

• Процесс:

  • В одном сосуде размещают раствор с высокой плотностью, а в другом — с низкой.

  • Через соединительный шланг растворы перетекают, создавая линейный градиент плотности.

• Особенности:

  • Метод прост в реализации и не требует сложного оборудования.

  • Подходит для экспериментов, где требуется плавный линейный градиент.

• Применение:

  • Разделение белков, вирусов, нуклеиновых кислот.

3. Перистальтический насос - Растворы с разной плотностью перемешиваются и подаются в центрифужную пробирку или ротор через перистальтический насос.

• Процесс:

  • Насос обеспечивает подачу растворов с заранее заданной скоростью.

  • За счет перемешивания растворов в процессе заполнения создается плавный или нелинейный градиент.

• Особенности:

  • Высокая степень автоматизации.

  • Возможность точного контроля над формой градиента.

• Применение:

  • Разделение мелких частиц, таких как нуклеопротеиды или мелкие органеллы.

4. Системы формирования градиента - Использование специализированных устройств для автоматической генерации градиента.

• Процесс:

  • Устройство соединяет два резервуара с растворами разной плотности.

  • Смесь подается в центрифужную пробирку с регулируемой скоростью, создавая заданный тип градиента (линейный, экспоненциальный и т. д.).

• Особенности:

  • Высокая точность и воспроизводимость.

  • Возможность создания сложных градиентов с заданными характеристиками.

• Применение:

  • Используется в высокоточных экспериментах, например, при разделении вирусных частиц или комплексов белков.

5. Центрифугирование, применение в очистке генно-инженерных белков.