Основные элементы устройства
Источник света:
Обеспечивает возбуждающее излучение (обычно УФ или видимый свет).
Чаще всего используют:
Ксеноновые лампы (широкий спектр).
Лазеры (узкий спектр, высокая интенсивность).
Монохроматоры:
Возбуждающий монохроматор: Выбирает определённую длину волны для возбуждения.
Эмиссионный монохроматор: Выделяет длину волны излучения для анализа.
Кюветное отделение:
Содержит образец в кювете (обычно из кварца, чтобы пропускать УФ-излучение).
Образец освещается перпендикулярно направлению детектирования, чтобы избежать влияния рассеянного света.
Детектор:
Регистрирует флуоресцентное излучение.
Обычно используется фотоумножитель (ПМТ) или ПЗС-матрица (CCD), обладающие высокой чувствительностью.
Система обработки данных:
Преобразует сигнал детектора в числовую информацию.
Включает аналогово-цифровой преобразователь и программное обеспечение для анализа.
Принцип работы
Возбуждение:
Источник света излучает широкий спектр волн, из которых возбуждающий монохроматор выделяет нужную длину волны.
Этот свет направляется на образец.
Флуоресценция:
Молекулы в образце поглощают излучение, переходя в возбуждённое состояние.
Затем они возвращаются в основное состояние, испуская свет с большей длиной волны (флуоресценция).
Регистрация флуоресценции:
Эмиссионный монохроматор выделяет длину волны излучения, которая регистрируется детектором.
Детектор преобразует свет в электрический сигнал.
Анализ данных:
Сигнал обрабатывается и представляется в виде спектра или численных данных.
Типы измерений
Спектр возбуждения:
Регистрируется интенсивность флуоресценции при фиксированной длине волны эмиссии, изменяя длину волны возбуждения.
Спектр эмиссии:
Регистрируется интенсивность флуоресценции при фиксированной длине волны возбуждения, изменяя длину волны эмиссии.
Временные характеристики:
Изучается время затухания флуоресценции после прекращения возбуждения.
Применение спектрофлуориметров
Аналитическая химия: Определение концентрации веществ.
Биология и медицина: Исследование белков, ДНК, взаимодействий молекул.
Экология: Определение качества воды и загрязняющих веществ.
Фармацевтика: Анализ лекарств и их взаимодействий.
Проточная цитофлуориметрия
Источник монохроматического света большой интенсивности, который можно сфокусировать для передачи значительной энергии анализируемым клеткам - лазер. Для создания ламинарного тока жидкости, содержащей анализируемые клетки, суспензия клеток под давлением через фильтр подается в концентрически протекающую жидкость со скоростью 30-40 км/час. Благодаря гидродинамической фокусировке создаются условия ламинарного потока без перемешивания суспензии клеток: клетки пересекают лазерный пучок, рассеивая его. Далее, через систему оптических линз, фильтров, зеркал трансформированный лазерный пучок преобразуется в фотоумножителе в электрические сигналы, которые обрабатываются и выдаются как характеристики клеток в виде цитограмм и гистограмм. Жизнеспособность клеток в процессе анализа не нарушается.
Лазерная цитометрия, измеряя степень светорассеивания под различными углами и флуоресценцию, позволяет идентифицировать клетки по их размеру, по ядерноцитоплазматическим соотношениям, по наличию гранул цитоплазмы, по специфически связанными с красителями рецепторам клеток. После анализа клеток по выбранным критериям по цитограмме можно выявить область, соответствующую клеточному типу, необходимую для выделения и более детального анализа.
13.Спектроскопия ЯМР. Спектрометры ЯМР, фурье-спектроскопия.
Ядерно-магнитный резонанс (ЯМР) основан на взаимодействии ядер с ненулевым спином с внешним магнитным полем. Это один из ключевых методов анализа химических соединений, позволяющий изучать их структуру, динамику и взаимодействия.
При отсутствии внешнего магнитного поля ориентация спинов хаотична, при наложении магнитного поля возникает система спиновых энергетических уровней.
Спектрометр с непрерывной развёрткой
Мощное магнитное поле получали с помощью электромагнита – полой медной трубки, намотанной на две катушки вокруг тяжёлого железного сердечника. Поскольку использовались большие токи – трубку охлаждали протекающей дистиллированной водой. Сейчас такие приборы не производят. Можно записать спектр, меняя напряжённость поля магнита Н0 при постоянной частоте генератора (развёртка поля), или изменяя частоту при постоянной напряженности поля (частотная развёртка). На первых этапах развития ЯМР чаще пользовались развёрткой поля. При этом в стандартных экспериментах напряжённость поля увеличивалась при движении каретки самописца вправо. Поэтому в обиход вошли выражения «сдвиг сигнала в сторону сильного поля» - т.е. вправо по стандартному спектру. Для получения спектра высокого качества развёртку осуществляли с малой скоростью, поэтому запись обычно занимала десятки минут.
