Иммунофлуоресценция
Иммунофлуоресценция — это метод, основанный на использовании флуоресцентно меченных антител для выявления антигенов в клетках или тканях. Различают два основных типа:
Прямая иммунофлуоресценция: Используется одно антитело, связанное с флуорофором, для связывания с антигеном.
Непрямая иммунофлуоресценция: Первое антитело связывается с антигеном, а второе (меченное флуорофором) распознаёт первое.
Применение:
Диагностика инфекционных заболеваний.
Определение локализации белков в клетках.
Исследование взаимодействий антиген-антитело.
Деполяризация флуоресценции
Деполяризация флуоресценции — изменение поляризации света (изменение угла отражения), испускаемого молекулой, из-за вращательной диффузии во время жизни её возбуждённого состояния.
Особенности:
Вязкость среды влияет на скорость вращения молекул.
В высоковязких средах деполяризация снижается.
Применение:
Изучение вязкости мембран.
Определение размеров молекул и их взаимодействий.
Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET)
FRET — это механизм передачи энергии между двумя молекулами (донор и акцептор), находящимися на расстоянии до 10 нм. Передача энергии происходит без испускания фотонов через диполь-дипольное взаимодействие.
Условия для FRET:
Спектр эмиссии донора должен перекрываться со спектром поглощения акцептора.
Молекулы должны быть близко расположены.
Применение:
Изучение взаимодействий белок-белок.
Измерение расстояний в макромолекулярных комплексах.
Анализ конформационных изменений молекул.
Флуоресцентные зонды
Флуоресцентные зонды — это молекулы, реагирующие изменением флуоресценции на параметры среды или связывание с определёнными молекулами.
Компоненты зонда:
Флуорофор: Излучает свет, изменяя интенсивность или спектр при изменении окружения.
Рецептор: Распознаёт целевые молекулы.
Примеры:
АНС: Используется для изучения гидрофобных областей мембран и белков.
Зонды для измерения рН, ионов кальция, натрия и калия.
Применение:
Исследование структуры мембран и белков.
Измерение параметров среды (pH, полярность).
Диагностика заболеваний.
Проточная цитофлуориметрия - метод, позволяющий быстро оценить состав клеточной популяции по флуоресценции и оптическим характеристикам клеток. С помощью этого метода можно определить абсолютное и относительное число клеток разных популяций и субпопуляций. К основным преимуществам метода относятся быстрота анализа и возможность одновременной оценки многих параметров клетки; размера, оптической плотности, поверхностных антигенов. Проточная цитофлуориметрия применяется также для анализа ДНК при исследовании клеточного цикла Для проточной цитометрии применяются моноклональные антитела, меченные флуорохромом (вещество, которое поглощает падающий свет определенной длины волны и излучает поглощенную энергию в виде света большой длины волны). В большинстве случаев антитела метят флуоресцетина изотиоцианатом или фикоэритрином. Другие флуорохромы, например техасский красный, родамин, аллофикоцианин, применяются с исследовательской целью
12.Спектрофлуориметры.
Использует не дифференциальный принцип– по сути сравнивает эмиссию с темнотой. Вследствие этого, чувствительность аппаратуры примерно на два порядка превышает спектрофотометрические методы. Калибровки спектрофлуориметров проводят с помощью специальных образцов.