Применение флуоресценции в биотехнологии

1. Флуоресцентная микроскопия:

   • Используется для изучения структуры клеток и их компонентов. Флуоресцентные красители (например, DAPI, флуоресцеин) позволяют визуализировать ядра, органеллы и белки.

2. Флуоресцентные белки:

   • Белки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его модификации (YFP, CFP), используются как генетические метки для изучения экспрессии генов, локализации белков и клеточных процессов.

3. Флуоресцентная спектроскопия:

   • Метод анализа, чувствительность которого на несколько порядков выше, чем у абсорбционной спектроскопии. Применяется для:

     • Идентификации и количественного определения веществ (например, витаминов, гормонов, ферментов).

     • Изучения взаимодействия белков, нуклеиновых кислот и малых молекул.

4. Флуоресцентные зонды:

   • Используются для измерения биохимических параметров, таких как pH, ионов кальция, натрия, калия, а также для оценки мембранного потенциала. Примеры: флуо-4, родамин-123.

5. FRET (резонансный перенос энергии Фёрстера):

   • Технология, основанная на флуоресценции, для изучения молекулярных взаимодействий на уровне нанометров. Применяется для анализа взаимодействия белок-белок или белок-нуклеиновая кислота.

6. Микроарреи и ДНК-чипы:

   • Флуоресцентные метки используются для идентификации последовательностей ДНК, РНК или анализа экспрессии генов.

7. Клеточные анализы:

   • Флуоресценция позволяет определять жизнеспособность клеток (например, с помощью PI или кальцеина), исследовать апоптоз, пролиферацию и фагоцитоз.

8. Тесты на молекулярном уровне:

   • Флуоресцентные технологии применяются в ПЦР в реальном времени (qPCR) для определения количества специфических нуклеиновых кислот в образце.

Преимущества флуоресцентных методов

• Высокая чувствительность: Возможность обнаружения молекул в концентрациях 10⁻⁵–10⁻⁶ моль/л и ниже.

• Специфичность: Позволяет избирательно исследовать компоненты сложных смесей.

• Быстрота анализа: Флуоресценция проявляется мгновенно.

• Гибкость применения: Широкий выбор флуоресцентных красителей и меток.

Факторы, влияющие на флуоресценцию

1. Структура молекул:

   • Симметричные молекулы с протяжённой системой сопряжённых связей и жёсткой структурой обладают высокой флуоресценцией.

   • Жесткость молекулы усиливается за счёт хелатных или водородных связей.

2. Влияние среды:

   • pH, растворитель, наличие кислорода или других тушащих агентов могут снижать интенсивность флуоресценции.

3. Концентрация вещества:

   • При высоких концентрациях происходит концентрационное тушение, нарушается линейная зависимость между интенсивностью флуоресценции и концентрацией.

Проблемы флуоресценции: тушение и рассеивание

Тушение флуоресценции

Тушение (квэнчинг) — снижение интенсивности флуоресценции из-за взаимодействия молекул флуорофора с внешними факторами. Виды тушения:

1. Динамическое: столкновения с тушителями (кислород, ионы металлов).

2. Статическое: образование неиспускающих комплексов флуорофора с тушителем.

3. Концентрационное: агрегация молекул при высоких концентрациях.

4. Фототушение: разрушение флуорофора под действием света.

Минимизация: удаление кислорода, контроль pH, оптимизация концентрации, использование устойчивых флуорофоров.

Рассеивание света

Рассеивание искажает сигнал, увеличивает фон и шум. Основные виды:

1. Релеевское: на частицах меньше длины волны света.

2. Ми-рассеивание: на частицах, сопоставимых с длиной волны.

3. Тиндалевский эффект: на крупных частицах в коллоидных системах.

Минимизация: очистка образцов (фильтрация), использование прозрачных растворителей, оптимизация геометрии эксперимента и спектральная коррекция.