1. Инфракрасная (ик) спектроскопия Описание метода:

ИК-спектроскопия основана на поглощении инфракрасного света молекулами, что вызывает переходы между вибрационными уровнями энергии. При этом молекулы должны обладать изменением дипольного момента.

Применяемые техники:

• Фурье-ИК спектроскопия (FTIR):

  • Использует преобразование Фурье для получения спектров с высокой разрешающей способностью.

  • Часто применяется для анализа сложных систем, таких как смеси белков, липидов и углеводов.

• Аттенюированное полное внутреннее отражение (ATR-ИК): Он позволяет анализировать поверхностные свойства образцов и получать спектры поглощения без сложной подготовки образцов. Этот метод основан на явлении полного внутреннего отражения света в определенных условиях. эЭто оптическое явление, которое происходит, когда свет переходит из среды с более высоким показателем преломления (от алмаза к чеу- то) в среду с более низким показателем преломления под углом, превышающим так называемый критический угол. При этом весь свет полностью отражается обратно в первую среду, не переходя во вторую. его и измереяют, я так поняла. Эванесцентное поле: Хотя свет не проходит во вторую среду, на границе создается слабое «затухающие» электрическое поле (эванесцентное поле), которое проникает в менее плотную среду на небольшую глубину.

  • Позволяет анализировать образцы без подготовки, включая твердые и жидкие биоматериалы.

  • Применяется для изучения структуры тканей, пленок и покрытий.

Применение:

• Изучение вторичной структуры белков (по амидным полосам I и II).

• Исследование липидных мембран и их фазовых переходов.

• Анализ взаимодействий между биомолекулами, например, белков и лигандов.

2. Раман-спектроскопия (спектроскопия комбинационного рассеяния) Описание метода:

Раман-спектроскопия основана на анализе рассеянного света, частота которого изменяется из-за взаимодействия с вибрационными состояниями молекул. В отличие от ИК-спектроскопии, этот метод чувствителен к изменениям в поляризуемости молекулы. ( проводитсяв среднем ик диапазоне )

Применяемые техники:

• Поверхностно-усиленная Раман-спектроскопия (SERS):

  • Использует металлические наноструктуры (золото, серебро), которые усиливают сигнал.

  • Применяется для анализа ультранизких концентраций биомолекул.

• Конфокальная микроскопия Рамана:

  • Объединяет микроскопию и Раман-спектроскопию для изучения структуры клеток и тканей с высоким пространственным разрешением.

• Временная Раман-спектроскопия:

  • Позволяет отслеживать динамику реакций в реальном времени.

Применение:

• Диагностика раковых тканей (по биомаркерам в Раман-спектрах).

• Анализ нативных белков, ДНК и липидов.

• Контроль чистоты биопрепаратов.

3. Спектроскопия комбинационного рассеяния ближнего ик-диапазона (nir-спектроскопия)

Описание метода:

NIR-спектроскопия использует ближний ИК-диапазон (800–2500 нм), где молекулы поглощают свет в результате обертонных и комбинационных переходов. Принцип работы: Излучение в ближнем ИК-диапазоне возбуждает обертонные и комбинационные колебания молекул. Этот диапазон менее специфичен, чем средний ИК, но более чувствителен к воде и органическим веществам.

Особенности:

• Высокая скорость анализа.

• Низкие требования к подготовке образцов.

Применение:

• Быстрый контроль качества биоматериалов.

• Анализ состава сложных смесей, таких как культуральные среды.

4. ИК-имиджинг (гиперспектральная спектроскопия) снимает кучу раз в куче точек

Описание метода:

Комбинирует пространственное разрешение и спектральный анализ, позволяя получать карты распределения химических соединений в образце.

Применение:

• Исследование гетерогенных биологических тканей.

• Локализация определенных молекул внутри клеток.

Общие черты методов и их выбор

Выбор метода зависит от типа исследуемого образца и поставленных задач:

• ИК-спектроскопия предпочтительна для молекул с изменением дипольного момента.

• Раман-спектроскопия лучше подходит для молекул с изменением поляризуемости.

• NIR-спектроскопия и другие методы удобны для быстрого анализа сложных смесей без подготовки.

11.Флуоресценция и ее применение в БТ.

Люминесце́нция — нетепловое свечение вещества, происходящее после поглощения им энергии возбуждения.

Фотолюминесценция — свечение под действием света (видимого и УФ-диапазона).

• флуоресценцию (время жизни 10⁻⁹−10⁻⁶ с); (спектр интенсивность от длины волны)

• фосфоресценцию (10⁻³−10 с);

Хемилюминесценция — свечение, использующее энергию химических реакций;

Биолюминесценция — способность живых организмов светиться, достигаемая самостоятельно или с помощью симбионтов.

Легче всего происходит переход, требующий наименьшей затраты энергии. Это условие соответствует переходу электрона с высшей (по энергии) занятой молекулярной орбитали (ВЗМО) на низшую свободную молекулярную орбиталь (НСМО). Электронно-возбужденные состояния содержат два неспаренных электрона на различных орбиталях, причем спины этих электронов могут быть одинаковыми (параллельными) или различными (антипараллельными). Такие состояния называются, соответственно, триплетными и синглетными и отличаются друг от друга по физическим и химическим свойствам. Названия "триплетный" и "синглетный" обозначают мультиплетность состояния, в данном случае спиновую мультиплетность. Мультиплетность — это число составляющих, на которые данный энергетический уровень расщепляется во внешнем магнитном поле.

Спектр возбуждения люминесценции - зависимость интенсивности люминесценции I от длины волны возбуждающего света

Спектр люминесценции - зависимость интенсивности люминесценции от длины волны люминесценции

Время жизни люминесценции – время, за которое интенсивность излучения уменьшится в е раз, поскольку затухание люминесценции происходит по закону: t - время люминесценции τ – время затухания люминесценции

Флуоресценция (~10^-8 c) – вид фотолюминесценции, при котором молекула переходит в основное состояние S0 из короткоживущего возбужденного состояния S*. Наблюдается сразу же после поглощения квантов света и быстро затухает в результате столкновений излучающей молекулы с другими молекулами в растворе.

Фосфоресценция (10^-3 с) – вид фотолюминесценции, при котором молекула переходит в основное состояние S0 из относительно долгоживущего возбужденного состояния S* → Т* → S0 , называется послесвечением. Для фосфоресценции характерны большая длина волны излучения, меньшая интенсивность

Закон Стокса - спектр фотолюминесценции лежит в более длинноволновой области по сравнению со спектром поглощения, т.к. энергия испускаемого кванта ниже, чем энергия поглощенного кванта.

Правило Каши – спектр флуоресценции (и фосфоресценции) не зависит от длины волны возбуждающего света, т.к. излучательный переход может происходить только с самого нижнего возбужденного колебательного уровня. Таким образом, для получения спектра флуоресценции (эмиссионного спектра) мы можем облучать объект монохромным светом.

Правило Левшина (закон зеркальной симметрии) – спектр испускания флуоресценции представляет собой зеркальное отражение спектра поглощения, поскольку структура колебательных подуровней одинакова в основном и возбуждённом состоянии.

Закон Вавилова – квантовый выход флуоресценции (Q) не зависит от длины волны возбуждающего света, т.к. излучательный переход может происходить только с самого нижнего возбужденного колебательного уровня. Квантовый выход Q - отношение числа излучаемых квантов N к числу поглощенных квантов No светового потока.

Флуоресцентная спектроскопия может быть использована для идентификации и количественного определения флуоресцирующих соединений. Она дополняет абсорбционную спектроскопию, но с той разницей, что флуоресцентный анализ на порядки чувствительнее. Такое увеличение чувствительности, прежде всего, обусловлено тем, что сигнал флуоресценции можно наблюдать, усилить и записать непосредственно, тогда как в поглощении измеренный сигнал представляет собой разность между интенсивностями падающего и прошедшего света.

Флуориметрия является мощным средством, используемым для анализа смесей. Часто флуоресцирует только один компонент смеси. Когда же флуоресцирует более чем один компонент, можно избирательно возбудить только один из компонентов, подбирая соответственно длину волны возбуждения. Флуоресценцию определяют в растворах с концентрацией 10^-5 — 10^-6 моль/л и меньше, когда между интенсивностью флуоресценции и концентрацией вещества наблюдается линейная зависимость. При более высоких концентрациях линейность нарушается, а затем наблюдается концентрационное тушение флуоресценции.

Интенсивность флуоресценции в значительной степени зависит от длины волны возбуждающего света, величины рН испытуемого раствора, природы растворителей и присутствия в растворе посторонних веществ, поглощающих некоторую долю

Замечено, что наибольшей способностью к люминесценции обладают симметричные молекулы с протяженной системой сопряженных связей, склонные к образованию орто- и пара-хиноидных колец. Наиболее значительным факторам, обуславливающим люминесценцию молекул, является жесткая и плоская структура молекулы. Образованию жесткой плоской структуры молекул способствует образование новых циклов или появление внутримолекулярных хелатных или водородных связей.