Все лк ген инжа
.pdf
РНК зависимые ДНК полимеразы (обратные транскриптазы,
ревертазы) – транскрипция мРНК в комплементарную цепь ДНК
Открыта в 1970 г. Х. Теминым, С. Мизутани.
• Состоит из двух субъединиц: α и β
3активности:
1.ДНК полимеразная (матрица как РНК, так и ДНК)
2.Активность РНКазы Н, (гидролиз РНК только в составе гибрида РНК ДНК)
3.ДНК эндонуклеазная
Первые две активности важны для
PDF Editor синтеза вирусной ДНК, эндонуклеаза важна для интеграции вирусной ДНК в геном клетки хозяина
• для синтеза необходим праймер
чтобы убрать водяной знак.
Этот документ был отредактирован с Активируйте
Использование обратных транскриптаз для получения кДНК
Обратные транскриптазы находят применение
•в синтезе дцДНК, комплементарной РНК для ее клонирования в плазмидных векторах при получении клонотек кДНК
•для введения метки в ДНК зонды
PDF Editor
чтобы убрать водяной знак.
Этот документ был отредактирован с Активируйте
Схема синтеза дц ДНК копий молекул РНК
Полинуклеотидкиназы
Осуществляют перенос гамма фосфатных групп ATP на 5' OH группы ДНК или РНК. и реакция обмена.
Полинуклеотидкиназа бактериофага Т4 широко используется для введения радиоактивной метки в ДНК или РНК для получения адиоактивно меченых зондов или секвенирования нуклеиновых кислот.
Используется 2 типа реакций:
1)Прямая реакция γ фосфатная группа переносится ферментом непосредственно к дефосфорилированному 5’
PDF Editor |
концу ДНК |
2)Реакция обмена присутствие в реакционной смеси избытка ADP вынуждает полинуклеотидкиназу осуществлять перенос фосфатной группы с 5’ конца ДНК
чтобы убрать водяной знакна. ADP с образованием ATP, а освободившаяся OH группа далее фосфорилируется γ фосфатом по обычному механизму.
Этот документ был отредактирован с Активируйте
Терминальная трансфераза
Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (выделена из тимуса) последовательно присоединяет дезоксирибонуклеозидмонофосфаты из пула дезоксирибонуклеозидтрифосфатов к 3’ OH группам молекул ДНК.
Используется
•для введения радиоактивной метки в составе меченых нуклеотидов
•для присоединения к 3’ концам протяженных гомополимерных последовательностей нуклеотидов (коннекторов) для их
клонирования
PDF Editor
чтобы убрать водяной знак.
Этот документ был отредактирован с Активируйте
Щелочные фосфатазы
Выделены из бактерий и кишечника теленка
Катализируют удаление 5’ фосфатных групп ДНК или
РНК, а также расщепление макроэргических связей рибо и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.
Применение:
• при подготовке фрагментов нуклеиновых кислот к введению 5’ PDF Editor концевой радиоактивной метки 32Р, а также для
предотвращения лигирования векторных молекул ДНК самих на себя.
чтобы убрать водяной знак.
Этот документ был отредактирован с Активируйте
Нуклеазы в генной инженерии
Гидролитические ферменты, расщепляющие фосфодиэфирные связи в нуклеиновых кислотах.
По механизму расщепления субстратов выделяют:
•экзонуклеазы – последовательное отщепление нуклеотидов ДНК или РНК
•эндонуклеазы – вносят в молекулу нуклеиновых кислот внутренние разрывы
PDF Editor
•К эндонуклеазам относятся многочисленные рестриктазы
• Некоторые нуклеазы могут обладать более чтобы убрать водяной знак. широкой специфичностью и гидролизовать и
ДНК, и РНК, а также проявлять экзо и эндонуклеазную активности.
Этот документ был отредактирован с Активируйте
Экзонуклеаза III E. coli
Катализирует последовательное отщепление 5’ нуклеотидов из дцДНК в направлении 3’ 5’.
Активности:
•эндонуклеазная (по отношению к апуринизированной ДНК)
•РНКазы H (гидролиз РНК в РНК ДНК гибридах)
•3’ фосфатазная
Экзонуклеаза фага лямбда
PDF Editor Катализирует последовательное отщепление 5’ мононуклеотидов в дцДНК при наличии в них 5’ концевых
фосфатных групп.
Применение:
• для получения молекул оцДНК с целью их
чтобы убрать водяной знак.
последующего секвенирования
Этот документ был отредактирован с Активируйте
Нуклеаза S1 (из Aspergillus orizae)
•в присутствии ионов Zn2+ специфически расщепляет молекулы оцДНК и РНК с образованием 5’ фосфорилированных моно и олигонуклеотидов
•специфически распознает и расщепляет оц участки в оц разрывах, брешах и петлях дц ДНК, но не в одиночных ошибочно спаренных нуклеотидах. Те же свойства присущи и нуклеазе золотистой
фасоли (mung bean), а также нуклеазе P1 из Penicillium citrinum.
Панкреатическая рибонуклеаза A (РНКаза
A)
•небольшой белок
•обладает активностью эндорибонуклеазы
• продукты гидролиза 3’ фосфорилированные пиримидиновые мононуклеотиды и олигонуклеотиды, содержащие концевые пиримидин 3’ монофосфаты
• во многих тканях всех млекопитающих обнаружен специфический чтобы убрать водянойбелковыйзнак. ингибитор RI, обладающий высоким сродством к
РНКазе A.
Этот документ был отредактирован с Активируйте
Панкреатическая дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I)
•эндонуклеаза, гидролизующую как одно , так и дцДНК с образованием смеси моно и олигонуклеотидов, содержащих 5’ фосфатные группы
•в присутствии ионов Mg2+ ДНКаза I независимо атакует каждую цепь ДНК, при этом места разрывов располагаются статистически вдоль молекулы, а в присутствии ионов Mn2+ расщепляет обе цепи ДНК приблизительно напротив друг друга
PDF Editor
чтобы убрать водяной знак.
Этот документ был отредактирован с Активируйте
Лекция 3
PDF Editor Химико ферментативный синтез нуклеиновых кислот
чтобы убрать водяной знак.
Этот документ был отредактирован с Активируйте