УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ

”ПОЛЕССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ“

Факультет биотехнологический

Кафедра биохимии и биоинформатики

УПРАВЛЯЕМАЯ САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА № 2

на тему:

Иммобилизованные растительные клетки

(Методы определения жизнеспособности клеток)

Подготовил					Децук Валерия Петровна
Студент 3 курса, гр.22БХ-1		(подпись) __________________

Проверил		Аль Меселмани Моханад Али
Доцент	(подпись)

ПИНСК 2024

Содержание

Глава 1. Иммобилизованные растительные клетки 3

Глава 2. Методы определения жизнеспособности иммобилизованных растительных клеток 4

Список используемой литературы 6

Глава 1. Иммобилизованные растительные клетки

Изолированные растительные клетки, как и клетки микроорганизмов, можно культивировать в искусственных условиях. Культуры растительных клеток и тканей используются для получения биопрепаратов. Более 90% известных природных соединений можно обнаружить в высших растениях. Культивируемые клетки тотипотентны, в них может экспрессироваться вся генетическая информация, что позволяет получать любые вещества из растений. Многие промышленно важные соединения, используемые в фармацевтике, пищевой и парфюмерной промышленности, выделяют из растительных тканей. Успехи в этой области были достигнуты за последние 20 лет. В Японии в 1983 году был внедрен промышленный способ получения природного соединения (шиконина).

Однако для промышленного использования растительных клеток необходимо решить проблемы, связанные с медленным ростом, способностью к агрегации, низким выходом и генетической нестабильностью. Для их устранения проводятся исследования по иммобилизации растительных клеток.

Преимущества иммобилизованных клеток:

• Более длительная стационарная фаза, что решает проблемы, связанные с замедлением роста клеток.

• Гомогенный препарат гранул геля, что частично устраняет проблему агрегации клеток.

• Наработка продукта происходит в неделящемся состоянии клеток, что снижает вероятность генетических изменений.

• Защитная полимерная матрица решает проблему низкой механической устойчивости клеток.

• Возможность индуцированной экскреции веществ с помощью периодической пермеабилизации, что позволяет многократно использовать биомассу.

Глава 2. Методы определения жизнеспособности иммобилизованных растительных клеток

Для сохранения биосинтетической активности большое значение имеет жизнеспособность клеточных препаратов. Для ее определения используют ряд методических приемов. Окрашивание. Окрашивание, в частности флуоресцеиндиацетатом (ФДА), часто используют для определения жизнеспособности клеток. После адсорбции ФДА клетками при наличии эстеразной активности он деацетилируется и становится флуоресцирующим. Окрашенные клетки рассматривают с помощью микроскопа, снабженного УФ-источником света. Отношение клеток, находящихся в данный момент времени на какой-либо стадии митоза, к их общему числу в популяции, выраженное в процентах, называют митотическим индексом (МИ). По его изменению в течение инкубации можно судить о жизнеспособности клеток. Удобным красителем для окраски хромосом после фиксации является карболфиксин. Зависимость митотического индекса от времени инкубации для суспендированных в среде и иммобилизованных растительных клеток представлена на рисунке 1.

Рисунок 1 ─ Митотический индекс для суспендированных (1) и включенных в агорозный гель (2) клеток Catharanthus roseus

Дыхание – критерий жизнеспособности клеток. Измерения проводят в течение инкубации через различные промежутки времени, например, с помощью кислородного электрода Кларка (рисунок 2).

Рисунок 2 ─ Дыхание клеток С. roseus,включенных в альгинатный гель (1), и тех же клеток после растворения полимера (2)

Клетки, суспендированные в среде (сырой вес 100–200 мг), или соответствующее количество иммобилизованных клеток (общий объем 5 мл) инкубируют при 25 0С. Регистрируют потребление кислорода, определяют сухой вес клеток и рассчитывают удельную скорость дыхания (рис. 5.2).

Очень часто дыхание иммобилизованных клеток менее интенсивно, чем дыхание такого же количества суспендированных клеток, что объясняется диффузионными затруднениями внутри полимерной сетки.

Рост и деление клеток. Увеличение числа и веса клеток является хорошим показателем их жизнеспособности. Однако в культуре число растительных клеток определить очень трудно, поскольку клетки растут в виде агрегатов различных размеров. Гораздо проще определить вес клеток (сырой или сухой) (рисунок 3).

Рисунок 3 ─. Зависимость увеличения сухого веса суспендированных клеток сои от времени инкубации

Список используемой литературы

1. Дж. Тао и Р. Дж. Казлаукас, Биокатализ для зеленой химии и разработка химических процессов, Уайли, Хобокен, Нью-Джерси, 2011 г.

2. Р. Вольгемут, Curr. Мнение. Биотехнология., 2010, 21, 713-724 .

3. Д. Муньос Солано, П. Хойос, М. Дж. Хернаис, А. Р. Алькантара и Дж. М. Санчес-Монтеро, Биоресурс. Технол., 2012, 115, 196-207

4. К. М. Клутьер и Дж. Н. Пеллетье, Chem. Soc. Rev., 2012, 41, 1585-1605 RSC .

5. У. Т. Борншойер, Г. В. Хьюисман, Р. Дж. Казлаускас, С. Лутц, Дж. К. Мур и К. Робинс, Nature, 2012, 485, 185-194