УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ

”ПОЛЕССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ“

Факультет биотехнологический

Кафедра биохимии и биоинформатики

УПРАВЛЯЕМАЯ САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА № 1

на тему:

Иммобилизация биокатализаторов

(Общие принципы методов иммобилизации)

Подготовил					Децук Валерия Петровна
Студент 3 курса, гр.22БХ-1		(подпись) __________________2023

Проверил		Аль Меселмани Моханад Али
Доцент	(подпись) ___________________2023

ПИНСК 2024

ОГЛАВЛЕНИЕ

Глава 1. Введение 3

Глава 2. Методы иммобилизации 5

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ 10

Глава 1. Введение

Ферменты являются устойчивыми катализаторами природы. Они биосовместимы, биоразлагаемы и получены из возобновляемых ресурсов. Ферментативные процессы проводятся в мягких условиях (близких к температуре окружающей среды, атмосферному давлению и физиологическому pH) в воде с высокой скоростью и селективностью. Кроме того, использование ферментов обычно устраняет необходимость в защите функциональных групп и / или активации, обеспечивая более экономичные способы синтеза, производящие меньше отходов и более энергоэффективные, чем традиционные методы органического синтеза. Короче говоря, ферментативные процессы более экологичны, более экономичны и, в конечном счёте, более устойчивы. Следовательно, за последние два десятилетия биокатализ стал важной технологией для удовлетворения растущего спроса на экологичное и устойчивое производство химических веществ, особенно при синтезе фармацевтических препаратов, ароматизаторов и отдушек, витаминов и других ценных химических веществ.

Благодаря достижениям в области биотехнологии и белковой инженерии теперь можно производить большинство ферментов по коммерчески приемлемым ценам и модифицировать их таким образом, чтобы они обладали желаемыми свойствами, в частности, субстратной специфичностью, активностью, избирательностью, стабильностью и оптимальным уровнем pH.

Несмотря на все эти преимущества, промышленному применению ферментов часто препятствует отсутствие долгосрочной стабильности в работе, а также сложность восстановления и повторного использования фермента. Эти недостатки, как правило, можно устранить с помощью иммобилизации фермента.7–10 Помимо более удобного обращения с ферментом в виде твёрдого, а не жидкого вещества, это позволяет легко отделить его от продукта, тем самым минимизируя или устраняя белковое загрязнение продукта. Кроме того, иммобилизованный фермент не может легко проникать в кожу и, следовательно, обладает низкой аллергенностью или не вызывает аллергию. Иммобилизация также способствует эффективному восстановлению и повторному использованию фермента, что позволяет экономически выгодно использовать его, например, в непрерывном процессе с неподвижным слоем. Дополнительным преимуществом является повышенная стабильность как при хранении, так и в рабочих условиях, например, в отношении денатурации под воздействием тепла или органических растворителей или в результате автолиза. Повышение эффективности ферментов и их многократное использование отражается на более высокой производительности катализаторов (кг продукта на кг фермента), которая, в свою очередь, определяет стоимость фермента на кг продукта.

Глава 2. Методы иммобилизации

Иммобилизованные ферменты получают путем связывания с носителями растворимых ферментов или клеток микроорганизмов, обладающих ферментативной активностью. Иммобилизация приближает условия функционирования ферментов к природным. В природе большая часть ферментов ассоциирована со структурами живых организмов или элементами окружающей среды, что важно для проявления активности ферментов и их стабильности.

Применение иммобилизованных ферментов позволило решить задачу крупных промышленных биокаталитических производств, с помощью которых производят аминокислоты, органические кислоты, органические растворители, метан, антибиотики, гормональные препараты, осуществляют очистку сточных вод и водоемов, биоконверсию органических отходов.

Рассмотрим основные способы закрепления ферментов на носителе:

Адсорбция на носителе. Носителями могут быть неорганические материалы (стекло, силикагель, оксид алюминия и т.д.), природные полимеры (целлюлоза, коллаген) и синтетические полимеры (нейлон, полиэтилен).

Включение в гель агар-агара, альгинатов, каррагинана, хитозана. Молекулы фермента сидят в порах геля. Гель проницаем для молекул субстрата и продуктов реакции за счет молекулярной диффузии.

Ковалентное связывание с носителем. Носителем является полимерный материал, длинные молекулы которого в разных местах связаны химическими ковалентными связями с молекулами фермента.

Поперечная «сшивка» молекул фермента при помощи бифункциональных реагентов. Молекулы фермента, свободно перемещаются в растворе, соединяются между собой различными своими участками с помощью определенных реагентов. Получается некое пространственное образование, включающее активные молекулы и довольно большие пространства между ними, удобные для диффузии молекул субстрата и продукта реакции.

Адсорбция на носителе с последующей поперечной «сшивкой», этот способ сочетает в себе способы 1 и 4. По сравнению с обычной адсорбцией на носителе получается более глубокий слой молекул фермента, доступных для субстрата и продукта, а по сравнению с обычной «сшивкой» - более прочная гранула, имеющая жесткий остов в центре.

Включение в полупроницаемые капсулы. Внутри капсулы находится раствор фермента. Внешняя оболочка капсулы довольно прочная, непроницаемая для фермента, но проницаемая для продукта и субстрата.

Сополимеризация фермента и полимера-носителя. Напоминает включение в гель, но матрица создается путем сополимеризации полифункционального реагента и фермента (т.е. фермент не просто находится в «клетке» геля, но и сцеплен с ней). Этот способ является сочетанием способов 2 и 4. Например, полиакриламидный гель, в котором в качестве реагента используется глутаровый альдегид.

Физическое смешение – перемешивание фермента и порошка носителя. Метод довольно прост, но не очень надежен. Фермент может отслаиваться от носителя и переходить в раствор. В целом для методов физической иммобилизации предлагается использовать следующую классификацию:

- иммобилизация на носителе или на поверхности носителя. В этом случае удерживающая поверхность или часть поверхности носителя «омывается» внешней средой.

- иммобилизация в носителе или в объеме носителя. Между внешней средой и препаратом в результате иммобилизации появляется слой материала носителя.

- иммобилизация с использованием мембранной технологии. Препарат и небольшая часть внешней среды помещены в замкнутый объем, отделенный от остальной среды избирательно проницаемой мембраной, размер пор, в которой таковы, что субстраты и продукты через них проникают, а иммобилизованный препарат удерживается внутри замкнутого объема.

При иммобилизации на носителе препарат может быть связан различными силами:

- адсорбционно неспецифически – взаимодействие базируется на не ковалентных контактах (ионные, гидрофобные, водородные);

- адсорбционно биоспецифически – носитель способен образовывать достаточно прочные комплексы с поверхностью препарата;

- химически удерживающая матрица должна иметь особые группировки, способные реагировать с компонентами препарата.

К достоинствам адсорбционной иммобилизации относятся исключительная простота методов ее проведения.

Способы адсорбционной иммобилизации разделяют на статические, с перемешиванием и путем нанесения на колонке.

Статический способ наиболее прост и заключается в том, что носитель вносят в суспензию биопрепарата и смесь некоторое время инкубируют. Иммобилизацию достигается за счет осаждения и адсорбции на частицах носителя. Недостатком этого способа является необходимость длительного контакта адсорбента с суспензией биопрепарата.

Способ с перемешиванием обеспечивает более быстрое завершение процесса адсорбции и более равномерное заполнение носителя.

Способ нанесения в колонке заключается в прокачивании суспензии с препаратом через колонку, заполненную носителем. Иногда для проведения адсорбционной иммобилизации применяют метод электроосаждения.

Иммобилизация в массе носителя один из самых распространенных. В качестве носителя применяют полимерный гель или полимерное волокно.

Обездвиживание препарата может быть за счет физических факторов, так и за счет фиксации с образованием ковалентных связей между компонентами препарата и веществом матрицы.

В этом варианте достигается более высокая удельная концентрация иммобилизованных препаратов в носителе, это дает возможность поднять продуктивность биотехнологического процесса в целом. Кроме того у получаемых препаратов хорошие эксплуатационные свойства. Препараты лучше защищены от многих неблагоприятных факторов среды.

При иммобилизации с использованием мембранной технологии важным фактором является толщина мембраны. С ее уменьшением происходит повышение проявляемой иммобилизованными биокатализаторами активности.

В мембранной технологии применяются следующие системы: плоские мембраны, пористые волокна и микрокапсулы.

Плоские мембраны – легко пропускают молекулы субстрата, но представляют собой непреодолимый барьер для крупных молекул фермента или клеток.

Пористые волокна – аналогично предыдущему случаю, но используются мембранные полые волокна. Эти волокна представляют собой длинные тонкие трубки, стенки которых выполнены из полимерной мембраны.

Такие препараты имеют более высокую продуктивность. Используют триацетат целлюлозы – дешевый и доступный носитель, а также коагулянт целлюлозы – гидрофильный носитель, с высокой механической прочностью.

Микрокапсулирование – водный раствор с биопрепаратом включают внутрь микрокапсул, представляющие собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой. Существует два подхода микрокапсулирования: диспергирование (образуются микрокапсулы) и гранулирование (образуются нити). Данная технология применяется очень широко.

Химические методы иммобилизации ферментов представляют иммобилизацию путем образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем и являются основным способом получения гетерогенных биокатализаторов. В отличие от физических методов иммобилизации данные методы обеспечивают прочную и необратимую связь фермента с носителем и сопровождаются стабилизацией молекулы энзима. При разных условиях протекания реакции фермент не загрязняет целевой продукт и не может оторваться от подложки. Кроме того, отсутствуют диффузионные ограничения, в связи с отсутствием барьера между ферментом и реакционной средой. При образовании новых химических связей можно направленно влиять на свойства фермента.

При химической иммобилизации важным условием является то, что образовавшиеся химические связи не должны затрагивать активный центр фермента. Однако расположение фермента относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создает трудности в осуществлении каталитического процесса. Поэтому чем дальше от поверхности носителя находится фермент, тем более просто к нему приблизиться молекуле субстрата. Существуют разные способы химической иммобилизации:

- ковалентное связывание белка с полимерным носителем. Однако химическая модификация может приводить к значительным изменениям свойств белка;

- сшивка молекул фермента с использованием бифункционального соединения, которое содержит две или более функциональных групп, которые способны связаться как с белком, так и с носителем. Благодаря вставке удается избежать снижения ферментативной активности иммобилизованного препарата.