БИОС.СИСТ. лекции

глюкозооксидазы: при концентрации глюкозы в растворе выше чем 2 мМ изменение температуры (в отсутствие термоизоляции измерительной ячейки) составляет около 2×10-4 оС. Между тем энтальпиметрические биосенсоры позволяют определять и более низкие концентрации глюкозы. По этой причине термометрические датчики представляют собой адиабатические миниреакторы. В отличие от сложных микрокалориметров теплота, выделяющаяся в миниреакторах, измеряется термисторами – полупроводниковыми сопротивлениями небольших размеров, обладающими высоким температурным коэффициентом. Это значительно упрощает и удешевляет систему. В аналитических системах используются термисторы с сопротивлением 2–150 кОм при 25 °С и с температурным коэффициентом от минус 3 до минус 5 %/град. Такими термисторами могут быть определены изменения температуры менее 0,001 оС.

Термометрические датчики могут быть сделаны в виде проточных адиабатических колонок. В этом случае процесс измерения тепловыделения производится путем определения разности температуры пробы на входе и выходе миниреактора. Например, простой энтальпиметрический биосенсор для определения концентрации мочевины на основе иммобилизованной уреазы представляет собой колонку длиной 2,5 см и внутренним диаметром 0,5 см, изготовленную из дьюаровской трубки. Трубка заполнена иммобилизованной на пористом стекле уреазой.

Термометрические датчики могут быть использованы для создания биосенсорных устройств на основе иммобилизованных ферментов, антител (антигенов), клеток и т. д.

3.6. Акустические датчики тест-реакции

Ранее указывалось, что тип датчика определяется особенностью реакций и превращений в тест-объекте биосенсора и невозможно найти какой-либо один, универсальный преобразователь сигнала на все случаи анализа. Поэтому рассмотреть все типы датчиков тест-реак- ции, применяемые для построения биосенсоров, невозможно в пределах курса лекций. Завершим раздел описанием принципа действия акустических датчиков.

В основу работы этих датчиков положено явление обратного пьезоэффекта – деформации пьезокристалла внешним электрическим полем. Прикладывание к граням пьезокристалла переменного напряжения воз-

84

буждает механические колебания. При этом для пьезокристалла характерно явление резонанса, причем резонансная частота возбуждающего переменного напряжения определяется упругими свойствами кристалла, его линейными размерами и массой. Под действием тест-процесса первые два параметра не изменяются. Однако в случае иммобилизации на поверхности кристалла тест-объекта, масса которого под действием анализируемой пробы изменяется, может произойти сдвиг резонансной частоты. Именно на основе определения степени сдвига резонансной частоты пьезокристалла, акустические датчики регистрируют изменение массы тест-объекта. Свое название эти датчики получили потому, что резонансная частота колебаний датчика лежит в звуковом и ультразвуковом диапазонах. Такие датчики позволяют зарегистрировать изменение массы в пределах 10-11–10-10 г. Акустические датчики могут быть использованы для построения биосенсорных устройств на основе антител (антигенов), иммобилизованных клеток или ферментов – во всех случаях, когда в качестве тест-реакции используются процессы, приводящие к изменению массы тест-объекта.

85

4

___________________________________________

ПОСТРОЕНИЕ БИОСЕНСОРНЫХ УСТРОЙСТВ

4.1.Ферментные электроды

Ферментные электроды представляют собой устройства, смонтированные на основе электрохимического датчика и иммобилизованного фермента, находящегося с первым в непосредственном контакте (см. рис. 7). Принцип действия ферментных электродов основан на диффузии субстрата в тонкий слой биокатализатора (тест-объекта). Продукты ферментативной реакции определяются электрохимическим датчиком. В зависимости от способа определения электроды разделяются на потенциометрические и амперометрические. Хотя принцип действия обоих типов ферментных электродов одинаков, амперометрические электроды отличаются от потенциометрических потреблением продуктов на поверхности электрохимического датчика. Сигналы датчиков также различаются: потенциометрические генерируют потенциал, амперометрические работают в режиме измерения тока. Эти различия обусловлены тем, что потенциометрические ферментные электроды конструируются на основе ионо- и газоселективных электродов, обладающих линейной зависимостью потенциала от логарифма концентрации определяемого вещества, в амперометрических же ток электрохимических датчиков прямопропорционально зависит от концентрации соединений или пропорционален скорости электрохимического процесса (в том случае, если в основе работы биосенсора лежат биоэлектрокаталитические реакции).

4.1.1. Потенциометрические ферментные электроды

Для изготовления потенциометрических ферментных электродов наиболее часто используются рН-электроды, ионоселективные электроды, чувствительные к ионам аммония, цианид-ионам, а также чувствительные к газам (СО2, NH3 и др.) мембранные электроды и электроды с воздушной щелью. Электрохимический датчик выбирается таким образом, чтобы субстрат или продукт ферментативной реакции можно было определять потенциометрически.

86

Для создания таких биосенсоров наиболее часто используются ферменты следующих классов: оксидазы (оксидазы аминокислот, глюкозооксидаза и др.), декарбоксилазы (например, тирозиндекарбоксилаза), гидролазы (уреаза, β-глюкозидаза, пенициллиназа и др.) и некоторые другие ферменты. Этими ферментами катализируются реакции:

оксидаза

R-CH(NH3+)-COO - + O2 + H2O R-COCOO - + NH4+ + H2O2, R-CH(NH3+)-COO - декарбоксилаза R-CH2NH3+ + CO2,

уреаза

(NH2)2CO + 2H2O CO2 + 2NH3 + OH- .

Вприведенных выше схемах продукты реакций, которые могут быть определены с помощью потенциометрических ионоселективных электродов или мембранных газовых электродов, подчеркнуты. Кроме того, все указанные выше процессы содержат продукты, вызывающие изменение рН. Большинство ферментных потенциометрических электродов предназначено для определения содержания различных органических соединений, однако в настоящее время разработаны биосенсоры указанного класса и для определения некоторых неорганических соединений. В табл. 5 приведены характеристики некоторых ферментных электродов.

С практической точки зрения наибольший интерес представляют электроды, чувствительные к АМФ и обладающие групповой специфичностью к аминокислотам, а также к отдельным аминокислотам благодаря использованию специфических оксидаз или декарбоксилаз. Для клинических измерений большой интерес представляют также электроды, чувствительные к мочевине и мочевой кислоте, для микробиологической промышленности – электроды, чувствительные к антибиотикам.

Интервал концентраций определяемых соединений лежит в области 10-5–10-2 М и зависит от применяемого фермента и электрохимического датчика.

Вподавляющем большинстве случаев для конструирования потенциометрических электродов используется один фермент. Однако, если продукты ферментативной реакции электрохимически неактивны, необходим такой подбор последовательных ферментативных реакций, чтобы за их ходом можно было следить потенциометрическим

87

88

датчиком. В качестве примера можно привести создание биосенсора, чувствительного к нитрат-иону, который восстанавливается до нитрита нитратредуктазой, а затем нитритредуктаза восстанавливает нит- рит-ион до аммиака.

Очевидно, в этом и подобных ему последовательных превращениях селективность системы должна уменьшаться. Такие электроды будут чувствовать не только начальные продукты, но и промежуточные. В целом не существует принципиальных ограничений для того, чтобы путем подбора ферментативных реакций создать потенциометрические биосенсоры для определения многих органических и неорганических соединений.

4.1.2. Амперометрические ферментные электроды

Для изготовления амперометрических ферментных электродов наиболее часто используются оксидазы аминокислот и спиртов, диаминооксидаза, глюкозооксидаза, холестериноксидаза, галактозооксидаза. Эти ферменты катализируют окисление органических соединений молекулярным кислородом с образованием перекиси водорода:

диаминооксидаза

R-CH2NH2 + O2 + H2O R-CHO + NH3 + H2O2

За ходом этих реакций можно следить как путем регистрации потребления кислорода, так и определения скорости образования перекиси водорода, поэтому ферментные электроды изготавливаются на основе кислородных и перекисных электрохимических датчиков. В реакциях фенолоксидазы перекись водорода не образуется, поэтому ферментные электроды созданы с использованием кислородных датчиков. Характеристики некоторых амперометрических биосенсоров на основе ферментов приведены в табл. 6.

89

В некоторых амперометрических биосенсорах применяются оксидазы, которые окисляют субстраты под действием других акцепторов электронов (М+). В электродах для определения молочной кислоты протекает реакция

СН3СН(ОН)СОО- + 2М+ цитохром b2 СН3СОСОО- + 2М* + 2Н+ .

Таблица 6

Характеристики некоторых амперометрических ферментных электродов

90

В качестве акцептора электронов наиболее часто используется феррицианид калия, окисленная форма которого легко образуется на платиновом аноде. Этот процесс и является тест-реакцией:

Fe(CN)64- Fe(CN)63- + e – .

Глюкозооксидаза катализирует процесс окисления глюкозы не только молекулярным кислородом, но и другими акцепторами электронов (феррицианид калия, хинон и др.):

Глюкоза + 2Fe(CN)63- + Н2 Глюконовая к-та + 2Fe(CN)64- + 2Н+.

На этом процессе основана конструкция одного из электродов для определения содержания глюкозы.

Когда продукты или субстраты ферментативной реакции электрохимически не активны, при создании амперометрических биосенсоров применяется последовательное превращение субстратов. На этом основано действие чувствительных к дисахаридам электродов. Для определения лактозы и мальтозы используются два фермента, одним из которых является глюкозооксидаза, окисляющая глюкозу:

Чтобы определить сахарозу, необходим еще дополнительный фермент, который эпимеризует α-глюкозу – продукт гидролиза сахарозы – в β-форму, окисляемую глюкозооксидазой:

мутаротаза

α-D-глюкоза β-D-глюкоза .

Скорость неферментативной мутаротации высока, поэтому можно отказаться от применения мутаротазы, хотя чувствительность электрода для определения сахара при этом сильно уменьшается.

91

Для определения фосфата используется также последовательное превращение глюкозо-6-фосфата с образованием глюкозы, которая определяется по описанному ранее методу. Скорость ферментативной реакции замедляется при наличии в исследуемом растворе фосфата:

щелочная фосфатаза

Глюкозо-6-фосфат + Н2О Глюкоза + НРО42-

Путем соответствующего подбора ферментативных реакций в принципе можно создать ферментные амперометрические электроды, чувствительные к другим органическим соединениям и ионам.

4.2. Применение микроорганизмов в электрохимических биосенсорах

Стабильность аналитических систем на основе иммобилизованных ферментов определяется в основном устойчивостью биокатализаторов. Многие клеточные ферменты, однако, являются весьма лабильными и неустойчивыми белками. Аналитические системы, созданные на основе этих биокатализаторов, обладают непродолжительным временем действия. Интактные клетки микроорганизмов содержат все ферментативные системы, необходимые для их жизнедеятельности. Они с высокой эффективностью преобразуют химическую и другие формы энергии, обладают необходимой стабильностью и регенеративностью. В клетках происходят превращения субстрата под действием полиферментных комплексов и систем, в которых участвуют коферменты. В связи с этим представляет интерес разработка методов, позволяющих сопрягать в аналитических системах клеточные ферментативные реакции с электродными процессами.

Существует ряд принципиальных возможностей использования микроорганизмов для аналитических целей. Вещества, влияющие на жизнедеятельность микроорганизмов, могут привести к изменению скорости выделения тепла или другой функции, например скорости дыхания, генерации мембранного потенциала и т. д. В других случаях индуцируется определенная ферментативная система, которая в клетках микроорганизмов может действовать подобно ферменту в микрокапсулах. Специфичность такого микро-реактора определяется ферментативной реакцией и проницаемостью клеточных мембран. В электрохимических микробных биосенсорах клетки микроорганизмов

92

захватываются на поверхности потенциометрических (ионоселективных или газовых) или амперометрических электродов. Под действием определенных ферментативных систем клеток субстраты трансформируются в продукты, которые и определяются электрохимическим датчиком, либо определение ведется по скорости потребления кислорода.

В селективном относительно аргинина биосенсоре применены клетки микроорганизмов Streptococcus faecium, которые широко используются для микробиологического определения аминокислот. В клетках микроорганизмов L-аргинин превращается в ионы аммония под действием следующих ферментативных реакций:

аргининдеаминаза

аргинин цитруллин + NH3

орнитинтранскарбомилаза

цитруллин+H3PO4 орнитин+карбамоилфосфат

карбамоилаткиназа

карбамоилфосфат+АДФ карбамоиловая к-та+АТФ карбамоиловая к-та СО2 + NH3.

Ионы аммония в больших количествах образуются только из аргинина, поэтому можно ожидать высокой селективности биосенсора относительно этой аминокислоты. Внеклеточный цитруллин не дает ионов аммония, так как клеточные мембраны для него непроницаемы.

Преимуществом бактериальных биосенсоров является возможность их регенерации. После 20-дневной эксплуатации и выдерживания в питательной среде в течение 2 суток, биосенсоры полностью восстанавливают свои параметры.

Чувствительный к аспартату биосенсор изготовлен на основе клеток Bacterium cadaveris и газового NH3-электрода. В клетках микроорганизмов аспартат метаболизируется следующим образом:

аспартаза

аспартат фумарат + NH3 .

Аспартаза – весьма нестабильный фермент. Электрод, изготовленный на основе очищенного фермента, инактивируется в течение 1 суток. Добавлением дитиотреитола к среде хранения бактериального электрода можно увеличить время его службы до 10 суток. Стабильность этого биосенсора значительно возрастает при выдерживании его в питательной среде, в которой ферментный электрод не восстанавли-

93