28. Оптические методы (крч лучше выучите 29)

Когда говорят об оптических методах определения содержания тех или иных веществ, то подразумевается использование для измерений особенностей взаимодействия с веществом электромагнитного излу- чения, лежащего в ультрафиолетовой (УФ), видимой или инфракрас- ной (ИК) частях спектра (в диапазоне, для которого характерны длины волн от 100 нм до 16 мкм). Оптические методы анализа содержания вещества в газовой или жидкой фазах главным образом основаны на следующих явлениях:

1) поглощении излучения веществом (колори- метрические и спектрофотометрические методы);

2) рассеянии излу- чения веществом (нефелометрические методы);

3) люминесценции вещества (спектрофлуоресцентные, хемо- и биолюминесцентные и другие методы).

На основе указанных явлений и базируются различ- ные конструкции биосенсоров.

1) Калориметрические (Колориметрический метод определения содержания вещества в среде основан на явлении поглощения квантов света определенной длины волны молекулами анализируемого вещества.)

2) Флуоресцентные ( Люминесценция проявляется в виде свечения веществ. Это свечение обусловлено возбуждением молекул люминесцирующего вещест- ва различными воздействиями.

3) Хемолюминесцентные зонды. Помимо конструкций спектрофлуориметрических датчиков, явление люминесценции используется в хемолюминесцентных детекторах, от- личающихся высокой чувствительностью регистрации микроколичеств определяемого соединения.

4) Наряду с явлением хемолюминесценции в биосенсорах использу- ется и биолюминесценция – свечение (in vivo или in vitro) при проте- кании биохимических превращений.

29. Характеристика оптических явлений, на основе которых производится оценка тест-реакции.

Когда говорят об оптических методах определения содержания тех или иных веществ, то подразумевается использование для измерений особенностей взаимодействия с веществом электромагнитного излучения, лежащего в ультрафиолетовой (УФ), видимой или инфракрасной (ИК) частях спектра (в диапазоне, для которого характерны длины волн от 100 нм до 16 мкм). Оптические методы анализа содержания вещества в газовой или жидкой фазах главным образом основаны на следующих явлениях:

1) поглощении излучения веществом (колориметрические и спектрофотометрические методы);

2) рассеянии излучения веществом (нефелометрические методы);

3) люминесценции вещества (спектрофлуоресцентные, хемо- и биолюминесцентные и другие методы).

На основе указанных явлений и базируются различные конструкции биосенсоров.

Колориметрический метод определения содержания вещества в среде основан на явлении поглощения квантов света определенной длины волны молекулами анализируемого вещества. Это наиболее старый из оптических методов оценки содержания в растворах окрашенных веществ. Степень поглощения света, проходящего через слой растворенного вещества, зависит от концентрации последнего в среде и толщины слоя.

Люминесценция проявляется в виде свечения веществ. Это свечение обусловлено возбуждением молекул люминесцирующего вещества различными воздействиями. В том случае, когда возбуждение осуществляется светом одной длины волны, а последующее свечение проявляется через относительно короткие интервалы времени в виде свечения в более длинноволновой области спектра, чем возбуждающий свет, говорят о флуоресценции.

Спектрофлуориметрический метод основан на количественном измерении интенсивности флуоресценции объектов в определенных участках спектра.

Помимо конструкций спектрофлуориметрических датчиков, явление люминесценции используется в хемолюминесцентных детекторах. Основой хемолюминесцентного метода является реакция, в ходе которой генерируется свет. Наряду с явлением хемолюминесценции в биосенсорах используется и биолюминесценция – свечение (in vivo или in vitro) при протекании биохимических превращений. Свечение свойственно многим живым организмам, принадлежащим к различным таксономическим группам.

30. Основные принципы конструирования оптических биосенсоров.

Принципиально работа биосенсорных устройств на основе опти- ческих датчиков тест-реакции не отличается от рассмотренных выше. Однако содержание продуктов реакции или исходного реагента оце- нивается по его оптическим свойствам или по изменению оптических свойств дополнительных зондов, взаимодействующих с продуктами реакции или исходными реагентами.

Рассмотрим принцип действия и конструкцию биосенсора на основе иммобилизованного рецептора – конканавалина А, предназначенного для определения содержания глюкозы. Этот биосенсор представляет собой конструкцию, состоящую из волоконнооптического светопровода, соединяющего с источником и детектором излучения замкнутую ячейку, отделенную от анализируе- мой среды полупроницаемой мембраной (рис. 20). Кроме рецептора, в измерительной ячейке находится декстран, меченный изотиоцианна- том флюоресцеина. Конканавалин А иммобилизован на внутренней поверхности полупроницаемой мембраны. Молекулы декстрана не способны диффундировать через полупроницаемую мембрану, в то время как глюкоза относительно легко диффундирует через нее. В от- сутствие глюкозы меченый декстран (А*) связывается с рецептором

Это приводит к тому, что большая часть меченого декстрана ока- зывается иммобилизованной на поверхности мембраны, что в свою очередь резко снижает флуоресценцию внутри ячейки (регистрирует- ся излучение, составляющее менее 20 % от максимальной величины). Когда присутствует глюкоза, отмечается конкуренция между мо- лекулами декстрана и углевода за места связывания на рецепторе. При этом часть молекул декстрана оказывается растворенной в объеме среды внутри ячейки. Причем чем больше концентрация глюкозы в анализируемой пробе, тем выше содержание растворенного декстрана внутри ячейки. Это, в свою очередь, приводит к возрастанию флуо- ресценции.

31.Колориметрические и люминесцентные индикаторы тест-реакции.

Колориметрические и люминесцентные индикаторы тест-реакции играют важную роль в аналитической химии и биотехнологиях, обеспечивая высокую чувствительность и специфичность при определении различных химических и биологических субстанций. Колориметрические методы основаны на изменении цвета, которое происходит в результате реакции индикатора с целевым веществом. Эти индикаторы часто используются в лабораторных анализах для количественной оценки концентрации анализируемых соединений.

С другой стороны, люминесцентные индикаторы предлагают более высокую чувствительность, поскольку основаны на явлении светоизлучения, возникающем при переходе молекул из возбужденного состояния в основное. Такой подход особенно полезен в микробиологии и клеточной биологии, где требуется обнаружение различных биомолекул, включая ДНК, РНК и белки. Люминесцентные индикаторы могут быть связаны с антителами или специфическими молекулами, что позволяет визуализировать клетки или молекулы на уровне, недоступном для традиционных методов.

Эффективное применение колориметрических и люминесцентных индикаторов требует глубокого понимания химических реакций и взаимодействий между индикаторами и анализируемыми веществами. Совершенствование методик и разработка новых индикаторов открывает перспективы для более точной диагностики и контроля качества в различных областях, от медицинских исследований до экологического мониторинга.